Antibakterielle Aktivität von vB

Jul 02, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7470 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Phagenlytische Enzyme sind vielversprechende antimikrobielle Wirkstoffe. In dieser Studie wurde ein von vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) abgeleitetes Endolysin identifiziert. Dieses Endolysin stellte die konservierte Lysozymdomäne dar. Rekombinantes Endolysin (lysAB-vT2) und hydrophobes Fusionsendolysin (lysAB-vT2-Fusion) wurden exprimiert und gereinigt. Beide Endolysine zeigten lytische Aktivität gegen die bakterielle Rohzellwand gramnegativer Bakterien. Die MHK der lysAB-vT2-Fusion betrug 2 mg/ml, entsprechend 100 µM, während die MHK von lysAB-vT2 mehr als 10 mg/ml (400 µM) betrug. Die Kombination von lysAB-vT2-Fusion mit Colistin, Polymyxin B oder Kupfer war synergistisch gegen A. baumannii (FICI-Wert 0,25). Die antibakterielle Aktivität von lysAB-vT2-Fusion plus Colistin bei fraktionierten Hemmkonzentrationen (FICs) zeigte, dass es Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und verschiedene Stämme von extrem arzneimittelresistenten A. baumannii (XDRAB) und phagenresistenten A. baumannii hemmen kann. Die lysAB-vT2-Fusion behielt ihre antibakterielle Aktivität auch nach 30-minütiger Inkubation des Enzyms bei 4, 20, 40 und 60 °C bei. Die lysAB-vT2-Fusion konnte den reifen Biofilm hemmen, und die Inkubation der lysAB-vT2-Fusion mit menschlichen T24-Zellen, die mit A. baumannii infiziert waren, führte zu einer teilweisen Verringerung der LDH-Freisetzung aus T24-Zellen. Zusammenfassend unterstreicht unsere Studie die antimikrobielle Fähigkeit des manipulierten LysAB-vT2-Fusionsendolysins, das zur Bekämpfung von A. baumannii-Infektionen eingesetzt werden kann.

Acinetobacter baumannii ist ein gramnegatives Bakterium, das sich als Hauptursache für nosokomiale Infektionen herausstellt und besonders problematisch für Patienten ist, die beatmet werden und längere Zeit im Krankenhaus bleiben. Assoziationen mit einer zunehmenden Inzidenz pan-resistenter A. baumannii, die einer Behandlung mit dem letzten Ausweg des Antibiotikums Colistin widerstehen, haben die Forschung nach neuartigen antimikrobiellen Wirkstoffen vorangetrieben. Ein potenzieller Kandidat ist die Phagentherapie, bei der lytische Bakteriophagen oder Phagenenzyme zur Behandlung bakterieller Infektionen eingesetzt werden, die gegen Antibiotika resistent sind1,2. Allerdings gibt es Einschränkungen bei der Verwendung von Phagenvirionen, einschließlich der Phagenspezifität für einen engen Wirtsbereich und der Möglichkeit einer Resistenzentwicklung3. Unsere vorherige Studie zeigte, dass 50 % der A. baumannii-Isolate in Thailand Phagenresistenzstämme gegen 17 getestete lytische A. baumannii-Phagen waren4. Daher besteht ein zunehmendes Interesse an der Verwendung von bakteriophagenlytischen Enzymen oder Endolysinen als antimikrobielle Wirkstoffe im Vergleich zur Verwendung von Phagenvirionen. Endolysine sind Phagenenzyme, deren Funktion darin besteht, die Peptidoglycanschicht zu hydrolysieren, was zu einem plötzlichen Abfall des Turgordrucks und einer osmotischen Lyse führt, was zum Absterben von Bakterienzellen führt5. Rekombinante Endolysine aus verschiedenen A. baumannii-Phagen wurden kloniert, exprimiert und charakterisiert6,7,8,9,10,11,12,13,14. Yuan et al. und Kim et al. zeigten, dass Endolysine Abtn-4 und LysSS eine breite antimikrobielle Aktivität gegen mehrere grampositive und gramnegative Bakterien zeigten. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Endolysine LysAB3, Abtn-4 und Abp013 den Biofilm von A. baumannii wirksam reduzieren9,13,14. Die Aktivität von Endolysinen wie LysABP-01, ABgp46, LysMK34 und ElyA1 kann durch die Kombination mit Permeabilisatoren für die äußere Membran wie organischen Säuren7 und Colistin8,10,11 gesteigert werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass gentechnisch veränderte Endolysine eine verbesserte antibakterielle Aktivität gegen Colistin-resistente A. baumannii-Stämme haben15.

In einer früheren Studie haben wir vB_AbaM_PhT2 identifiziert, das die beste Wirksamkeit gegen seinen Wirt und verschiedene A. baumannii-Stämme zeigte. Dieser Bakteriophage zeigte auch eine Synergie mit Colistin16. Eine Genomanalyse von vB_AbaM_PhT2 wurde mithilfe von Next Generation Sequencing (NGS) durchgeführt und ermöglichte die Identifizierung mutmaßlicher Gene, die Lysin kodieren. Diese Enzyme hydrolysieren das Peptidoglycan in bakteriellen Zellwänden und sind daher gute Kandidaten als Antibiotika-Alternativen. Obwohl viele Endolysine in A. baumannii charakterisiert wurden, gibt es weniger Studien zur Rolle des hydrophoben Aminosäurefusionsendolysins. Die Lysefähigkeit von E. coli-Endolysin wurde durch die Zugabe einer hydrophoben Aminosäure am C-Terminus des Endolysins verbessert17. Daher wollten wir die antimikrobielle Aktivität von rekombinanten Phagen-Endolysinen und hydrophoben Fusions-Endolysinen sowie ihre potenzielle Synergie mit Antibiotika, Desinfektionsmitteln, Schwermetallen und Phagen untersuchen. Fusionsendolysine zeigten im Vergleich zu nativen Enzymen eine hohe lytische Aktivität. Es wurden Zytotoxizitätstests, die Hemmung der Biofilmbildung und die antimikrobielle Aktivität gegen verschiedene Stämme von A. baumannii-Isolaten aus verschiedenen thailändischen Krankenhäusern von Fusionsendolysinen untersucht.

Wir untersuchten das Genom des Phagen vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) (MN864865), um das Endolysin-Gen zu identifizieren. Das Endolysin wurde im Genom des Phagen vPhT2 nachgewiesen (QHJ75684.1). Das lysAB-vT2 enthält 187 Aminosäurereste, während die lysAB-vT2-Fusion 199 Aminosäurereste enthält (Abb. 1A). Eine Lysozym-konservierte Domäne wurde von den Aminosäuren 65 bis 180 nachgewiesen (Abb. 1A). Die Sequenz des vPhT2-Endolysin-Gens ergibt eine Sequenzidentität von 53,53–60,54 % mit dem Endolysin-Gen des Phagen RL_2015 (Zugangsnr. AJG41873.1) und des Phagen AM24 (Zugangsnr. APD20282.1) (Abb. 1B). Der Vergleich der Aminosäuresequenz von lysAB-vT2 mit Endolysin aus dem Phagen RL_2015 und dem Phagen AM24 ist in Abb. 1C dargestellt.

Charakterisierung und bioinformatische Analyse von Endolysin LysVTh2 (lysAB-vT2). (A) Schematische Darstellung der konservierten Domäne von mutmaßlichem Endolysin (LysVTh2, lysAB-vT2) und Fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-Fusion). Dieses Diagramm wurde mithilfe des Pfam-Webservers vorhergesagt. (B) Bootstrap-Konsensbaum, der die phylogenetische Beziehung zwischen LysVTh2 (lysAB-vT2) und zuvor gemeldeten 16 A. baumannii-Lysinen zeigt. Die Evolutionsgeschichte wurde mithilfe der Neighbor-Joining-Methode mit 1.000 Bootstrap-Replikationen abgeleitet und in MEGA 11 durchgeführt. (C) Vergleichsanalyse von vB_AbaM_PhT2 (LysVTh2, lysAB-vT2), AM24 (Zugangsnummer APD20282.1) und RL-2015 (Zugangsnr. AJG41873.1) Endolysine unter Verwendung des Mehrfachsequenzvergleichs durch den Clustal Omega-Algorithmus.

Sowohl lysAB-vT2 als auch lysAB-vT2-Fusion wurden in löslicher Form exprimiert. Die beiden Ausbeuten an gereinigtem rekombinantem Protein betrugen 5,16 bzw. 4,44 mg pro Liter Kultur. Die gereinigten Proteine ​​wurden mittels SDS-PAGE untersucht und es wurden Banden von etwa 25 kDa beobachtet, was der vorhergesagten Molekülmasse von 25 kDa entspricht (Abb. 2).

Proteinexpressionsanalyse und Plattenlysetest von Endolysin (LysVTh2, lysAB-vT2) und Fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-Fusion). SDS-PAGE-Analyse zur Expression und Reinigung von (LysVTh2, lysAB-vT2) und Fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-Fusion). Spur M, mit BLUeye vorgefärbte Proteinleiter; Spuren 1: nicht-induziertes Bakterienlysat; Spur 2: IPTG-induziertes Bakterienlysat; Spur 3, das gereinigte Endolysin (LysVTh2, lysAB-vT2) und Fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-Fusion) nach der Dialyse.

Das rekombinante Protein wurde in einem Plate-Spot-Assay verwendet, um die lytische Aktivität beider Endolysine gegen bakterielle Rohzellen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Proteine ​​eine lytische Aktivität gegenüber den A. baumannii-Stämmen ATCC 19606, MDRAB und XDRAB hatten (Abb. 3). Sie haben auch lytische Aktivität gegen andere gramnegative Rohzellen wie E. coli, P. aeruginosa und K. pneumoniae (Abb. 3). Beim grampositiven Stamm S. aureus wurde jedoch keine lytische Aktivität festgestellt. Die Hemmzone von gereinigtem Fusions-LysVTh2 war größer als die von gereinigtem LysVTh2 und dem Eiweiß-Lysozym (Tabelle S1).

Plattenlysetest des gereinigten Endolysins (LysVTh2, lysAB-vT2) und Fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-Fusion) gegen A. baumannii. Der Plattenlysetest des gereinigten Endolysins (LysVTh2, lysAB-vT2) und Fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-Fusion) gegen A. baumannii wurde unter Verwendung autoklavierter Zellen von A. baumannii ATCC 19606, A. baumannii AB003 (MDRAB), A. baumannii AB329 (XDRAB), Ps. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 27736 und S. aureus ATCC 6538. Als Positivkontrolle wurde Eiweißlysozym (EWL) verwendet.

Wir verglichen die Wirksamkeit zweier rekombinanter Endolysine, indem wir die MHK ermittelten. Die MHK von gereinigtem lysAB-vT2 oder lysAB-vT2-Fusion wurde mithilfe von Tests zur Hemmung des Bakterienwachstums auf ihre Fähigkeit getestet, das Wachstum lebensfähiger Zellen von A. baumannii ATCC 19606 zu hemmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die MHK von lysAB-vT2-Fusion war 2 mg/ml entsprechend 100 µM, während die MHK von lysAB-vT2 mehr als 10 mg/ml (400 µM) betrug.

Wir haben die Wirkung der lysAB-vT2-Fusion in Kombination mit Antibiotika, Desinfektionsmitteln, Schwermetallen und dem Bakteriophagen vPhT2 untersucht. Die MHK aller getesteten Wirkstoffe sind in Tabelle S2 aufgeführt. Der synergistische Effekt der lysAB-vT2-Fusion wurde durch einen Wachstumshemmungstest bei 0,25 × der MHK zweier Wirkstoffe untersucht. Wie in Abb. 4A gezeigt, zeigte die Kombination beider Endolysine plus Colistin und Polymyxin B eine erhöhte antibakterielle Aktivität, gefolgt von CuCl2 mit einer prozentualen Hemmung von 95,8, 73,1 bzw. 31,5 % (Tabelle S3). Es wurde eine geringe Wechselwirkung mit EDTA (16,3 %), ZnCl2 (7,4 %), quartärer Ammoniumverbindung (7,3 %) und Imipenem (5,9 %) mit LysAB-vT2-Fusion beobachtet (Tabelle S3). Bei der Kombination von lysAB-vT2-Fusion mit Chloroxylenol, Natriumhypochlorit und dem Bakteriophagen vPhT2 gab es keine Wechselwirkung. Wir führten einen Schachbretttest zur Messung der Antibiotika-Synergie von Colistin, Polymyxin B und CuCl2 durch. Die fraktionellen Hemmkonzentrationen (FICs) für die Kombination von lysAB-vT2-Fusion mit Colistin betrugen 9,76 und 0,5 µg/ml, Polymyxin B betrug 11,71 und 0,5 µg/ml und CuCl2 betrug 10,15 µg/ml und 1,62 mM (Abb. 4B). ). Die FIC-Indizes der LysAB-vT2-Fusion und aller drei Wirkstoffe wurden mit 0,25 berechnet, was auf Synergismus hinweist (Abb. 4B).

Screening und Bestätigungstests für synergistische Interaktion und Synergiemessung durch Schachbrettanalyse. (A) Die Wachstumshemmungsrate (das Balkendiagramm) der lysAB-vT2-Fusion mit drei Antibiotika (Imipenem, Colistin und Polymyxin B), drei Desinfektionsmitteln (quartäre Ammoniumverbindung, Chloroxylenol, Natriumhypochlorit) und zwei Schwermetallen (ZnCl2, CuCl2). ) und Bakteriophage vPhT2. Die Daten werden als mittlerer Prozentsatz ± SD von Dreifachexperimenten ausgedrückt. (B) Schachbrettassay der LysAB-vT2-Fusion mit Colistin, CuCl2 und Polymyxin B.

Um die antimikrobielle Wirksamkeit von lysAB-vT2-Fusion zu bewerten, wurde die antibakterielle Aktivität von lysAB-vT2-Fusion allein und von LysAB-vT2-Fusion in Kombination mit Colistin gegen verschiedene Stämme von A. baumannii und anderen Bakterienarten bestimmt (Tabelle S4). Von den 27 getesteten A. baumannii-Stämmen wurden 14 Stämme mit 2 mg/ml Enzym mit einer prozentualen Hemmung von mehr als 85 % gehemmt (Abb. 4B und Tabelle S5). Wir fanden eine erhöhte antibakterielle Aktivität von lysAB-vT2-Fusion plus Colistin, die E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 27736, phagenresistente A. baumannii MDRAB-, XDRAB- und NR-Stämme hemmen kann. Darüber hinaus kann das Enzym in Kombination mit Colistin das Wachstum von 22 von 26 A. baumannii-Stämmen mit einer Hemmung von mehr als 90 % hemmen (Tabelle S6). Enzym allein oder Enzym mit Colistin zeigten eine geringe Hemmung von Colistin-resistenten A. baumannii (Abb. 5).

Antibakterielle Aktivität von lysAB-vT2-Fusion und lysAB-vT2-Fusion plus Colistin, Polymycin B und CuCl2. Antibakterielle Aktivität von lysAB-vT2-fusion (2 mg/ml) (schwarzer Balken), lysAB-vT2-fusion plus Colistin (10 ug/ml + 0,5 ug/ml) (grüner Balken), lysAB-vT2-fusion plus Polymyxin B (10 µg/ml + 0,5 µg/ml) (blauer Balken) und lysAB-vT2-Fusion plus CuCl2 (10 µg/ml/1,62 mM) (roter Balken) wurden mithilfe eines Hemmtests gegen E. coli, P. aeruginosa bestimmt , K.pneumoniae und verschiedene Stämme von A. baumannii.

Ein thermischer Stabilitätstest wurde durchgeführt, um die Hitzebeständigkeit der antibakteriellen Aktivität von lysAB-vT2-Fusion zu analysieren. Unsere Daten zeigten, dass die lysAB-vT2-Fusion nach der Inkubation bei 20 °C ihre antibakterielle Aktivität beibehielt und die prozentuale Hemmung bei fast 95 % lag. Die Ergebnisse der lysAB-vT2-Fusion nach Inkubation des Enzyms bei 4, 20, 40 und 60 °C zeigten, dass die prozentuale Hemmung bei fast 75 % lag. Bei 80 °C sank die prozentuale Hemmung der lysAB-vT2-Fusion auf 30 % (Abb. 6). Die prozentuale Verringerung der Proteinkonzentration war bei 4, 20 und 40 °C gering. Wir fanden heraus, dass die prozentuale Verringerung der Proteinkonzentration bei 80 °C auf 80 % reduziert wurde (Abb. 6).

Thermische Stabilität der lysAB-vT2-Fusion. Die thermische Stabilität der antibakteriellen Aktivität von lysAB-vT2-Fusion wurde mithilfe eines bakteriellen Hemmungstests mit 2 mg/ml lysAB-vT2-Fusion nach 20-minütiger Inkubation bei 4, 20, 40, 60 und 80 °C bestimmt. Der schwarze Balken repräsentierte die prozentuale Hemmung des Enzyms nach der thermischen Behandlung und der graue Balken repräsentierte die prozentuale Verringerung der Proteinkonzentration.

Die Zerstörung des bakteriellen Biofilms und die Zytotoxizität der LysAB-vT2-Fusion wurden bestimmt, um mögliche Einsatzmöglichkeiten der LysAB-vT2-Fusion zu bewerten. Der Biofilm-Assay zeigte, dass wir bei Exposition von 4 mg/ml lysAB-vT2-Fusion und 1 × 108 PFU/ml des Phagen vPhT2 mit 72-Stunden-Biofilmen von A. baumannii eine signifikante Verringerung der in den Biofilmen verbleibenden CFU fanden. Enzymkonzentrationen von weniger als 4 mg/ml erhöhten die Biofilmbildung (Abb. 7A).

Biofilm und Zytotoxizität der lysAB-vT2-Fusion. (A) Der MBEC-Assay quantifizierte die Störung reifer A. baumanni AB183-Biofilme durch unterschiedliche Konzentrationen der lysAB-vT2-Fusion. Biofilme von A. baumanni AB183 wurden über 3 Tage auf MBEC-Platten mit 96 Vertiefungen gebildet und die Endolysin-vermittelte Abtötung von Biofilmbakterien wurde durch eine anschließende 24-Stunden-Behandlung unter Verwendung von Endolysinverdünnungen, bei denen nur Biofilmzellen gemessen wurden, quantifiziert. (B) Adjuvante Wirkung der lysAB-vT2-Fusion (2 mg/ml) bei gleichzeitiger und gestaffelter Behandlung (nach 24 Stunden) des Bakteriophagen vPhT2 (Φ2) auf reife A. baumanni AB183-Biofilme * Sternchen bezeichnen P ≤ 0,05 *** Sternchen bezeichnen P ≤ 0,001.

Um die adjuvante Wirkung von lysAB-vT2-Fusionsendolysin mit dem Phagen vPhT2 auf die Clearance von A. baumann-Biofilmen zu beurteilen, wurde die Behandlung durch gleichzeitige und aufeinanderfolgende Exposition beurteilt. Unsere Daten zeigen, dass die sequentielle Behandlung mit Endolysin für 24 Stunden und dann mit dem Phagen vPhT2 für weitere 24 Stunden die Anzahl der KBE im Biofilm nicht signifikant verringerte (Abb. 7B). Allerdings führt die gleichzeitige Behandlung reifer Acinetobacter-Biofilme durch lysAB-vT2-Fusion (2 mg/ml) und Phagen vPhT2 (1 × 108 PFU/ml) zu deutlich geringeren in den Biofilmen verbliebenen CFU (p < 0,05), was auf eine gleichzeitige Behandlung schließen lässt Die Behandlung von Endolysin und Phagen ist besser als gestaffelt.

Bei den Zytotoxizitätstests schien die basale LDH-Aktivität mit etwa 40 % relativ hoch zu sein. Die alleinige LysAB-vT2-Fusion schien im Vergleich zum Grundzustand zu einem Anstieg der LDH-Freisetzung aus menschlichen T24-Zellen um etwa 10 % zu führen. Dies wurde als statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (*; p < 0,05) zurückgegeben. Die gleichzeitige Inkubation der lysAB-vT2-Fusion mit menschlichen T24-Zellen, die mit AB183 infiziert waren, führte zu einer teilweisen Verringerung der LDH-Freisetzung aus T24s (ca. 15 % Verringerung im Vergleich zu Zellen mit AB183 und zugesetztem leerem Vehikel), was darauf hinwies, dass das Endolysin dazu in der Lage war Inaktivierung von AB183 bei einer Konzentration von 2 mg/ml, die relativen Zytotoxizitätswerte blieben jedoch hoch (~ 75 %) (Abb. 8A).

Zytotoxizität von Endolysin (Fusion-LysVTh2) gegenüber menschlichen Epithelzellen. AB183 wurde über Nacht in Leibovitz-Medium gezüchtet und 1 Stunde lang zur Infektion von Zellen verwendet, bevor 2 mg/ml lysAB-vT2-Fusion zu relevanten Proben hinzugefügt und weitere 23 Stunden lang inkubiert wurden. Anschließend wurde ein LDH-Zytotoxizitätstest mit dem Invitrogen CyQUANT-Kit durchgeführt. (A) Erholung und Zytotoxizität der lysAB-vT2-Fusionsbehandlung von menschlichen T24-Epithelzellen, die mit A. baumanni AB183 infiziert sind. (B) Zytotoxizität nach Erholung menschlicher T24-Epithelzellen von einer AB183-Infektion nach Behandlung mit gleichzeitigem LysAB-vT2-Fusionsendolysin und antimikrobiellen Mitteln; CuCl2 (1,62 mM) und Colistinsulfat (0,5 µg/ml).

Um das Potenzial für die Verwendung von Endolysinen mit anderen antimikrobiellen Mitteln zu bewerten, wurde die Zytotoxizität der gleichzeitigen Behandlung infizierter und nicht infizierter menschlicher Epithelzellen mit lysAB-vT2-Fusion und den antimikrobiellen Mitteln Kupferchlorid (CuCl2) und Colistinsulfat beurteilt. Die Behandlung von mit AB183 infizierten und nicht infizierten menschlichen T24-Epithelzellen mit lysAB-vT2 (2 mg/ml) und Kupferchlorid (1,62 mM) ergab keinen signifikanten Unterschied in der LDH-Freisetzung im Vergleich zur unbehandelten/nicht infizierten Kontrolle. Dasselbe wurde bei der Exposition von T24-Zellen gegenüber lysAB-vT2-Fusion (2 mg/ml) und Colistinsulfat (0,5 µg/ml) festgestellt, ohne dass es einen Unterschied in der Zytotoxizität gegenüber T24-Zellen im Vergleich zu Kontrollen mit spontaner Freisetzung gab. Die AB183-Infektion von T24-Zellen wurde auch in allen antimikrobiellen Behandlungskombinationen erfolgreich behandelt (Abb. 8B).

Von Bakteriophagen abgeleitete Enzyme wie Endolysine wurden untersucht, um der Entstehung multiresistenter Bakterien entgegenzuwirken. In dieser Studie haben wir das Endolysin-Protein von vPhT2 untersucht.

Die Vielfalt der Endolysine hängt von der enzymatischen katalytischen Domäne (ECD) ab, die für die Spaltung einer spezifischen Peptidoglycan-Bindung verantwortlich ist, und von Zellbindungsdomänen (CBD), die für die Erkennung spezifischer Epitope auf der bakteriellen Zellwand verantwortlich sind18. Endolysine mit einer Zellwandbindungsdomäne (CBD) wurden nur in einigen A. baumannii-Bakteriophagen identifiziert, bei denen es sich um die Endolysine ElyA1 und ElyA2 handelte, die am N-terminalen Ende eine Peptidoglycan-Bindungsdomäne PG3 enthielten (11). Die BLAST-Analyse von lysAB-vT2 sagte eine ECD und eine Lysozym-konservierte Domäne voraus, in diesem Endolysin fehlte jedoch ein CBD (Abb. 1A). Die ECD der Endolysine lysAB-vT2 waren eine Muramidase (N-Acetyl-β-D-Muramidase), die β-1,4-glycosidische Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und einem N-Acetylglucosamin spaltet, was mit früheren Berichten übereinstimmt7. 8. Phylogenetische Beziehungsstudien zwischen lysAB-vT2 und anderen A. baumannii-Lysinen zeigten, dass es eng mit einem Endolysin aus dem nicht klassifizierten Phagen RL_2015 und dem 2014 isolierten Phagen AM24 (Moskau, Russland) verwandt ist19.

Zwei rekombinante Endolysine wurden exprimiert und gereinigt. In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht stellten wir fest, dass beide Endolysine das Brettspektrum zeigten, um autoklavierte Zellen gramnegativer Bakterien zu lysieren8. Die MHK von nativem lysAB-vT2 lag über 10 mg/ml. Aufgrund des Mangels an CBD in nativem lysAB-vT2 kann das native Endolysin die innere Peptidoglykanschicht im periplasmatischen Raum gramnegativer Bakterien nicht passieren und erreichen17. Darüber hinaus haben wir im Genom von vPhT2 einen Holin-Lyse-Mediator (GenBank: QHJ75701.1) gefunden. Holine sind Phagen-kodierte Membranproteine, die den Zugang von Phagen-kodierten Endolysinen zum Peptidoglycan steuern und dadurch den Lyseprozess auslösen. Die physikochemischen Eigenschaften gramnegativer Lysine, wie Nettoladung, Hydrophobie, hydrophobes Moment und aliphatischer Index, sind für eine verbesserte Wechselwirkung mit der gramnegativen Hülle verantwortlich20. Daher erzeugten wir eine hydrophobe Aminosäurefusion mit Endolysin von lysAB-vT2, da hydrophobe Polypeptide das Eindringen in die äußere Membran ermöglicht hatten21. Im Vergleich zu nativem lysAB-vT2 war die MHK der lysAB-vT2-Fusion auf das Fünffache verringert und wir haben uns auf die Aktivität der lysAB-vT2-Fusion konzentriert. Der Lipidteil am C-Terminus der lysAB-vT2-Fusion trug dazu bei, das Antibiotikum über seinen Lipidteil an der Bakterienmembran zu verankern, wie von Anikin et al.22 berichtet.

Über die Kombination von Colistin und Endolysin gegen klinische Stämme multiresistenter Bakterien wie A. baumannii und P. aeruginosa wurde in vitro und in vivo berichtet 8,11. Unsere Studie ergab, dass die Wechselwirkungen zwischen lysAB-vT2-Fusion eine erhöhte antibakterielle Aktivität mit Colistin, Polymyxin B und CuCl2 aufwiesen. Colistin und Polymyxin B sind positiv geladene Antibiotika, die über die negativ geladenen Phosphatgruppen von Lipid A und seiner hydrophoben terminalen Acylfettkette binden und so eine Ausdehnung der äußeren Außenmembran (OM) bewirken23. Es kommt zu einer Permeabilisierung des OM, wodurch Endolysin durch das OM gelangen und die hydrolysierende Peptidoglycanschicht spalten kann. Es gab keinen Unterschied in der Kombination von lysAB-vT2-Fusion mit Imipenem beim 0,25-fachen MHK-Wert beider Wirkstoffe. Imipenem, ein Beta-Lactam-Antibiotikum aus der Klasse der Carbapeneme, wirkt durch die Inaktivierung der Penicillin-bindenden Proteine ​​(PBPs). Auf der Sub-MIC-Ebene ist der Zugang beider Wirkstoffe zum Peptidoglycan aufgrund der bakteriellen Außenmembran als strukturelle Barriere eingeschränkt. Darüber hinaus werden Kupferionen (Cu+) als antimikrobielle Wirkstoffe in der Landwirtschaft und im Gesundheitswesen eingesetzt. Bei Werten unterhalb des MHK-Werts können die Zellen, die Kupferoberflächen ausgesetzt sind, eine Membranschädigung auslösen24 und ermöglichen, dass Endolysin durch das OM gelangt, was zu einer verstärkten antibakteriellen Aktivität des Enzyms führt. Die lysAB-vT2-Fusion plus Colistin kann das Wachstum verschiedener Stämme von A. baumannii, wie XDRAB, MDRAB, hemmen, nicht jedoch des Colistin-resistenten A. baumannii (COLRAB). Dieses Phänomen kann durch die Tatsache erklärt werden, dass die MHK von COLRAB in dieser Studie 32 µg/ml betrug und eine niedrige Konzentration von Colistin (0,5 µg/ml) in Kombination mit Enzym verwendet wurde und diese Konzentration möglicherweise nicht ausreicht, um das Äußere zu zerstören Die äußere Membran (OM) der Colistin-resistenten Stämme verhindert die Funktion des Enzyms.

Um lysAB-vT2-Fusion als antibakterielles Produkt im klinischen Umfeld einzusetzen, wurden thermische Stabilität, Biofilmtests und Zytotoxizität von lysAB-vT2-Fusion bestimmt. Tests zur thermischen Stabilität zeigten, dass das Endolysin in einem breiten Temperaturbereich von 4 bis 60 °C noch funktioniert. Bei 80 °C sank jedoch die prozentuale Hemmung der lysAB-vT2-Fusion aufgrund der Denaturierung des Proteins. In Übereinstimmung mit früheren Berichten kann die lysAB-vT2-Fusion die Biofilmbildung hemmen und reife Biofilme verringern10,25,26. Unsere Studie ergab, dass 4 mg/ml Endolysin und der Phagen vPhT2 reife Biofilme hemmen können. Die MBEC-Konzentration war höher als der MHK-Wert. Dieses Phänomen kann durch die Struktur der Biofilme erklärt werden, die von einer Matrix aus extrazellulärer Polymersubstanz (EPS)26 umgeben sind und zu einem hohen MBEC beitragen. Es wurde festgestellt, dass die lysAB-vT2-Fusion in Verbindung mit einer Phagentherapie wirksam zur Zerstörung von A. baumann-Biofilmen eingesetzt werden kann. Im Gegensatz zu Erkenntnissen in der Literatur, die eine gestaffelte antimikrobielle Phagentherapie für wirksamer halten, erwies sich die gleichzeitige Behandlung mit Phagen und lysAB-vT2-Fusionsendolysin als wirksamer als eine aufeinanderfolgende Behandlung bei der Zerstörung von Biofilmen27. Dieser Vorfall kann dadurch erklärt werden, dass Phagen-Endolysine im Gegensatz zu traditionelleren antimikrobiellen Mitteln den Phagen-Lebenszyklus in Biofilmen nicht beeinträchtigen.

Im Gegensatz zu früheren Berichten erwiesen sich A. baumannii-Phagen und Phagenenzyme als sicher und zeigten keine Zytotoxizität gegenüber menschlichen Zelllinien12,16, selbst wenn sie in Kombination mit anderen antimikrobiellen Mitteln verwendet wurden. Unsere Studie ergab, dass das Endolysin in der Lage ist, A. baumannii zu inaktivieren und so Zelltoxizität zu verursachen, die relativen Zytotoxizitätswerte bleiben jedoch hoch. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass im Vergleich zur vorherigen Studie eine hohe Konzentration des Enzyms verwendet wurde.

Zusammenfassend haben wir das hydrophobe Aminosäurefusionsendolysin LysAB-vT2-Fusion des Phagen geklont und exprimiert. Dieses Enzym hat eine antibakterielle Aktivität, kann den reifen Biofilm verringern und hat eine synergistische Wirkung mit Colistin. In Kombination mit Colistin oder allein kann dieses Enzym verschiedene Stämme von A. baumannii hemmen, darunter MDRAB, XDRAB und phagenresistente A. baumannii.

Der Bakteriophage vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) (MN864865) wurde wie zuvor beschrieben isoliert und charakterisiert10. Um die antibakterielle Aktivität zu testen, verwendeten wir A. baumannii-Isolate, die zwischen 2006 und 2021 in fünf Krankenhäusern in Thailand gesammelt wurden, und A. baumannii, das 2021 aus der Krankenhausumgebung des Universitätskrankenhauses Naresuan isoliert wurde (Tabelle S1). Bei den A. baumannii-Stämmen handelte es sich um arzneimittelempfindliche A. baumannii (NR), multiresistente A. baumannii (MDRAB), extrem arzneimittelresistente A. baumannii (XDRAB), Carbapenem-resistente A. baumannii (CRAB), Colistin-resistente A . baumannii (COLRAB) und phagenresistente A. baumannii-Stämme (PRAB) aus einer früheren Studie28. Die Antibiotikaempfindlichkeit aller Isolate wurde gemäß CLSI 201729 bestimmt und ist in Tabelle S1 dargestellt. A. baumannii-Stämme wurden in Luria-Bertani (LB)-Brühe oder Agar gezüchtet. Rekombinante E. coli BL21 (DE3), die die Konstrukte pET28a-lysAB-vT2 und pET28a-lysAB-vT2-fusion enthielten, wurden in Luria-Bertani (LB)-Brühe und Agar gezüchtet, ergänzt mit 50 µg/ml Kanamycin und 10 µg/ml von Chloramphenicol. Das Protokoll wurde vom Institutional Biosafety Committee der Naresuan University genehmigt und die Projektnummer lautete NUIBC MI 64-08-32.

Das Endolysingen von vPhT2 (Zugangsnummer MN864865), flankiert von den Restriktionsstellen BamHI und EcoRI in pET28a, wurde mithilfe eines Gensynthesesystems (Genskript) generiert. Darüber hinaus wurde die hydrophobe Endolysin-Fusion in pET28a durch Hinzufügen eines für hydrophobe Aminosäuren kodierenden Gens (FILIVFVLIIAP) am C-Terminal erzeugt. Die pET28a-Vektoren, die das Endolysin-Gen (lysAB-vT2) und die hydrophobe Endolysin-Fusion (lysAB-vT2-Fusion) enthielten, wurden in E. coli DH5α transformiert und die Plasmide wurden gereinigt und in E. coli BL21 (DE3) pLysS subkloniert. Zur Überprüfung der Integrität des klonierten Fragments wurde ein Restriktionsverdau verwendet. Zur Überexpression rekombinanter Phagenenzyme wurde eine logarithmische Phasenkultur von E. coli BL21 (DE3) pLysS, die pET28a mit lysAB-vT2 oder lysAB-vT2-Fusion (A600–0,5) enthielt, durch Zugabe von IPTG bis zur Endkonzentration von 1 induziert mm. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen pelletiert, gewaschen und bei –80 °C eingefroren. Die gefrorenen Zellen wurden in 10 ml Lysepuffer (145 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4) resuspendiert. Die Proben wurden drei- bis viermal eingefroren und dann aufgetaut. Anschließend wurden 100 µl Triton Danach wurden die Proben 10 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert. Überstände (lösliche Fraktion) wurden gesammelt, um die rekombinanten Proteine ​​mithilfe einer His-Tag-Affinitätschromatographiesäule (His·Bind Kits, Novagen, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen. Die gereinigten Proteinfraktionen wurden gepoolt und über Nacht gegen Dialysepuffer dialysiert. Die Reinheit des Proteins wurde durch 12 % SDS-PAGE überprüft, gefolgt von der Färbung der SDS-PAGE-Gele mit Coomassie Brilliant Blue G-250.

Plattenlysetests wurden wie zuvor beschrieben7 unter Verwendung von Bakterienzellen von A. baumannii ATCC 19606, A. baumannii AB003 (MDRAB), A. baumannii AB329 (XDRAB), Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 oder Staphylococcus durchgeführt aureus ATCC 6538. Bakterien wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet, gesammelt, einmal gewaschen und in PBS suspendiert. Anschließend wurde die Suspension autoklaviert und zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in PBS (2 % [Vol./Vol.] des ursprünglichen Kulturvolumens) resuspendiert und als Substrat verwendet. 5 µl gereinigte Enzyme (4 mg/ml) wurden auf die Agarplatte (1,5 %) mit dem Substrat (5 %) getüpfelt. Als Kontrolle wurde ein gleiches Volumen von 20 µg Eiweiß-Lysozym (EWL) verwendet. Die getüpfelten Platten wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden klare Zonen beobachtet und der Durchmesser der klaren Zonen gemessen.

Die MHK von lysAB-vT2 oder lysAB-vT2-Fusion gegen klinische Isolate von A. baumannii ATCC 19606 und A. baumannii wurde gemäß der Standard-Bouillon-Mikroverdünnungsmethode des Clinical and Laboratory Standards Institute24 bestimmt. Kurz gesagt, zweifache Verdünnungsreihen jedes Enzyms wurden in Mueller-Hinton-Brühe (MHB) in einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte mit U-Boden hergestellt. Das Inokulum wurde durch Kultivierung von A. baumannii auf LBA hergestellt und über Nacht bei 37 °C aufbewahrt. Kolonien von A. baumannii wurden in 0,85 % NaCl-Lösung bei einer Inokulumkonzentration von 0,5 McFarland unter Verwendung eines Densitometers resuspendiert, um eine Konzentration von 1 × 105 KBE/ml zu erreichen. Jede Vertiefung wurde mit 50 µl Bakterienlösung beimpft, so dass die Endkonzentration des Inokulums 0,5 × 105 KBE/Vertiefung betrug. Die Platte wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. MHK wurde als die niedrigste Konzentration an Enzymen definiert, die das sichtbare Wachstum hemmte.

Die Wechselwirkungen zwischen lysAB-vT2 oder lysAB-vT2-Fusion mit drei Antibiotika (Imipenem, Colistin und Polymyxin B), drei Desinfektionsmitteln (quaternäre Ammoniumverbindung (QACs), Chloroxylenol, Natriumhypochlorit), zwei Schwermetallen (CuCl2, ZnCl2) und Bakteriophagen vPhT2 wurde durch einen Wachstumshemmungstest bei 0,25 × der MHK von zwei Wirkstoffen gescreent. Der Wirt zum Testen aller Wirkstoffe war ATCC 19606. A. baumannii AB329 wurde zum Testen des Bakteriophagen verwendet. Die prozentuale Hemmung wurde nach der folgenden Formel berechnet

Zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen lysAB-vT2-Fusion und den ausgewählten Antibiotika30 wurde die Schachbrettbrühe-Mikroverdünnungsmethode verwendet. Testergebnisse von zwei Wirkstoffen, die einzeln oder in Kombination wirken, wurden zur Berechnung des FIC-Index (FICI) verwendet, der die Summe der fraktionellen Hemmkonzentrationen (FICs) zweier Wirkstoffe nach der Formel war: FIC-Index = FIC der lysAB-vT2-Fusion + FIC des Antibiotikums, wobei FIC lysAB-vT2-Fusion die MHK der LysAB-vT2-Fusion in der Kombination/MHK von LysAB-vT2-Fusion allein ist und FIC Antibiotikum die MHK des Antibiotikums in der Kombination/MHK von Antibiotika allein ist.

Der FIC-Index verstärkter Wirkstoffe wurde wie folgt interpretiert: FIC ≤ 0,5, synergistisch; FICI = 0,5–4, Additiv oder Indifferenz; und FICI > 4, antagonistisch25.

Antibakterielle Aktivität von lysAB-vT2-Fusion gegen E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, K. pneumoniae ATCC 27736 und verschiedene Stämme von A. baumannii, die arzneimittelempfindliche Stämme (NR) und multiresistente A. baumannii waren (MDRAB), extrem arzneimittelresistenter A. baumannii (XDRAB), Carbapenem-resistenter A. baumannii (CRAB) und Colistin-resistenter A. baumannii (COLRAB) wurden getestet. Kurz gesagt, A. baumannii wurde in LB-Agar kultiviert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen in LB-Brühe verdünnt und die Trübung der Zellsuspensionen auf einen äquivalenten McFarland-Standard von 0,5 eingestellt, gemessen mit einem Densitometer, was etwa 1 × 108 KBE/ml entspricht. Die eingestellten Zellsuspensionen wurden 1:100 in doppelt verstärkter Mueller-Hilton-Brühe verdünnt und 50 µl wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten-Wells U unten (Nunc, USA) inokuliert. In jede Vertiefung wurden 50 µl der Enzyme in der MHK-Konzentration (2 mg/ml) oder Enzyme (10 µg/ml) mit Colistin (0,5 µg/ml) in Konzentrationen unterhalb der MHK gegeben. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden 50 μl 0,1 % filtersterilisiertes TTC (Hi-media) hinzugefügt. Die Platte wurde 3 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption bei OD540 wurde mit einem Synergy 2 Multimode-Mikroplattenlesegerät (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) gemessen. Das Experiment wurde zweimal mit dreifachen Proben wiederholt. Die prozentuale Hemmung gegen alle A. baumannii wurde wie zuvor beschrieben berechnet7.

Um die Stabilität der antibakteriellen Aktivität unter verschiedenen Temperaturbedingungen zu bestimmen, wurden 2 mg/ml lysAB-vT2-Fusion bei 4, 20, 40, 60 und 80 °C jeweils 30 Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde die antibakterielle Aktivität mithilfe eines Bakterienhemmtests bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde nach der thermischen Behandlung gemessen und die prozentuale Proteinreduktion berechnet.

Für den Biofilm-Assay wurden das Endolysin und der Phagen vPhT2 auf den 72-Stunden-Biofilm-produzierenden Stamm A. baumannii AB183 angewendet und die Fähigkeit des gereinigten Endolysins, 72-Stunden-Biofilme zu beseitigen, wurde mit dem Minimum Biofilm Eradication Concentration Assay (MBEC-Assay) bewertet. Biofilme wurden über 72 Stunden in LB-Brühe bei 37 °C gezüchtet und 24 Stunden lang unterschiedlichen Konzentrationen an gereinigtem Endolysin und 1 × 108 PFU/ml Phagen vPhT2 in Mueller-Hinton-Brühe ausgesetzt. Endolysin-Phagen-Adjuvans-Assays wurden durchgeführt, indem 72 Stunden reife AB183-Biofilme gleichzeitig und nacheinander mit Phagen und Endolysin behandelt wurden, wobei bei der sequentiellen Behandlung die Biofilme zunächst 24 Stunden lang mit Phagen vPhT2 und anschließend 24 Stunden lang mit LysAB-vT2-Fusionsendolysin behandelt wurden. Nach der Behandlung wurden die Biofilme in PBS beschallt und die Anzahl der überlebenden Bakterien im Biofilm durch Ausplattieren des resultierenden PBS, der den beschallten Biofilm enthielt, quantifiziert, um die CFU zu bestimmen. Für den Zytotoxizitätstest wurden menschliche T24-Harnblasenepithelzellen (ATCC® HTB-4™) und A. baumannii AB183 verwendet und wie zuvor beschrieben vorbereitet (Styles 2020). LDH-Zytotoxizitätstest, durchgeführt mit dem Invitrogen CyQUANT-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Alle Tests wurden unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung einer Einweg-ANOVA für Gruppenvergleiche mit der Kontrolle und eines ungepaarten T-Tests für paarweise Vergleiche durchgeführt (Abb. 7A). p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Datensätze für diese Forschung sind in den ergänzenden Tabellen enthalten.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Newton Fund – NRCT Thailand Research and Innovation Partnership Fund, des British Council Newton Fund Institutional Links Award, Antrags-ID: 623760210 an SS und APS sowie durch den Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) und die University of unterstützt Warwick finanzierte die Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP) [Fördernummer BB/M01116X/1] an GKD, NB und APS.UL wurde von The Royal Golden Jubilee Ph.D. unterstützt. Programm (PHD/0227/2560). GKD und NB haben ein Doktorandenstipendium, das von der Midlands Integrative Biosciences Training Partnership finanziert wird. PT wurde durch den Institutional Links Grant (623760210) im Rahmen des UK-Thailand Research and Innovation Partnership Fund finanziert.

Abteilung für Mikrobiologie und Parasitologie, Medizinische Fakultät, Naresuan-Universität, Muang, Phitsanulok, 65000, Thailand

Sutthirat Sitthisak, Suphattra Manrueang, Supat Khongfak, Udomluk Leungtongkam, Rapee Thummeepak und Aunchalee Thanwisai

Kompetenzzentrum für medizinische Biotechnologie, Medizinische Fakultät, Naresuan-Universität, Phitsanulok, 65000, Thailand

Sutthirat Sitthisak

School of Life Sciences, University of Warwick, Coventry, CV4 7AL, Großbritannien

Nathan Burton, Gurneet K. Dhanoa, Timothy Tsapras und Antonia P. Sagona

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SS und APS: Konzeption und Betreuung der Studie; SS, APS, RT, AT: konzipierten und gestalteten die Experimente; SS: Interpretation von Daten; SM, SK, UL, NB, GKD, PT: führten die Daten- und bioinformatische Analyse durch; UL, SM, SK, NB, GKD, PT: führten Experimente durch und bereiteten die Figuren vor, SS: schrieben den ersten Entwurf des Manuskripts; APS: Manuskript bearbeitet; SS und APS: Finanzierungseinwerbung. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Sutthirat Sitthisak oder Antonia P. Sagona.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sitthisak, S., Manrueang, S., Khongfak, S. et al. Antibakterielle Aktivität des hydrophoben Aminosäurefusionsendolysins des Phagen vB_AbaM_PhT2 in Kombination mit Colistin gegen Acinetobacter baumannii. Sci Rep 13, 7470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33822-8

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Eingegangen: 31. August 2022

Angenommen: 19. April 2023

Veröffentlicht: 08. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33822-8

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