Angström

Jan 09, 2024

Nature Band 617, Seiten 711–716 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Fluoreszenzmikroskopie ist mit ihrer molekularen Spezifität eine der wichtigsten Charakterisierungsmethoden in den Lebenswissenschaften, um komplexe biologische Systeme zu verstehen. Superauflösungsansätze1,2,3,4,5,6 können in Zellen eine Auflösung im Bereich von 15 bis 20 nm erreichen, Wechselwirkungen zwischen einzelnen Biomolekülen treten jedoch auf Längenskalen unter 10 nm auf und die Charakterisierung der intramolekularen Struktur erfordert eine Ångström-Auflösung. Hochmoderne Superauflösungsimplementierungen7,8,9,10,11,12,13,14 haben unter bestimmten In-vitro-Bedingungen räumliche Auflösungen bis zu 5 nm und Lokalisierungsgenauigkeiten von 1 nm gezeigt. Solche Auflösungen lassen sich jedoch nicht direkt auf Experimente in Zellen übertragen, und die Ångström-Auflösung wurde bisher nicht nachgewiesen. Hier stellen wir eine DNA-Barcoding-Methode vor, die Auflösungsverbesserung durch sequentielle Bildgebung (RESI), die die Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie bis hin zur Ångström-Skala unter Verwendung handelsüblicher Fluoreszenzmikroskopie-Hardware und -Reagenzien verbessert. Durch die sequentielle Abbildung spärlicher Zieluntergruppen mit moderaten räumlichen Auflösungen von >15 nm zeigen wir, dass eine Einzelproteinauflösung für Biomoleküle in ganzen intakten Zellen erreicht werden kann. Darüber hinaus lösen wir experimentell den DNA-Rückgratabstand einzelner Basen in DNA-Origami mit Ångström-Auflösung auf. Wir verwenden unsere Methode in einer Proof-of-Principe-Demonstration, um die molekulare Anordnung des Immuntherapie-Targets CD20 in situ in unbehandelten und medikamentenbehandelten Zellen abzubilden, was Möglichkeiten zur Bewertung der molekularen Mechanismen der gezielten Immuntherapie eröffnet. Diese Beobachtungen zeigen, dass RESI durch die Möglichkeit der intramolekularen Bildgebung unter Umgebungsbedingungen in ganzen intakten Zellen die Lücke zwischen hochauflösender Mikroskopie und Strukturbiologiestudien schließt und somit Schlüsselinformationen zum Verständnis komplexer biologischer Systeme liefert.

Die Lokalisierungsgenauigkeit (σSMLM) eines Zielmoleküls in der Weitfeld-Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM)15 wird letztendlich und grundsätzlich durch die Anzahl der Photonen (N) begrenzt, die pro Blinkereignis gesammelt werden: \({\sigma }_{{\rm {SMLM}}}\ approx \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) (σDIFF ist der sd der Punktspreizfunktion (PSF) der Optik Bildgebungssystem16; Abb. 1a). Mehrere Lokalisierungen desselben Ziels (Abb. 1b, oben) sind aufgrund ihrer endlichen Präzision um die wahre Position verteilt. Zwei oder mehr Punkte, die durch SMLM nicht auflösbar sind, erzeugen überlappende Lokalisierungsverteilungen und schließen somit eine eindeutige Zuordnung von Lokalisierungen zu jeweiligen Zielen aus (Abb. 1b, unten). Wenn jedoch jede Lokalisierung anhand der Farbe, des Barcodes oder einer anderen molekularen Identität einem bestimmten Ziel zugeordnet werden könnte, könnten sie eindeutig nach Ziel gruppiert werden2.

a: In SMLM skaliert σSMLM eines einzelnen Farbstoffs mit \(\frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\, was letztendlich die erreichbare räumliche Auflösung begrenzt. b: SMLM-Ansätze wie DNA-PAINT weisen eine räumliche Auflösung von etwa 10 nm auf (die Auflösung entspricht ungefähr der Halbwertsbreite ≈ 2,35 σSMLM). Während Ziele, die 20 nm voneinander entfernt sind (d1), routinemäßig aufgelöst werden können, sind Objekte mit einem Abstand von 2 nm (d2) nicht auflösbar, da sich die resultierenden Lokalisierungsverteilungen überlappen. c: Mithilfe orthogonaler DNA-Sequenzen (blau und grün) und sequenzieller Erfassung wie in Exchange-PAINT können Lokalisierungen von Zielen, die näher als die SMLM-Auflösungsgrenze liegen, jedem Ziel eindeutig zugeordnet werden. d: Durch die Kombination aller Lokalisierungen pro Ziel (K) für jede Bildgebungsrunde wird die Lokalisierungsgenauigkeit von sd (σSMLM) auf sem (σRESI) verbessert. e: Da die Superauflösung die Fluoreszenzmikroskopie revolutioniert hat, führt RESI zu einem weiteren Paradigmenwechsel, indem das Konzept der Lokalisierung erneut auf hochauflösende Daten angewendet wird. f: Die Lokalisierungsgenauigkeit in RESI skaliert mit \(\frac{1}{\sqrt{K}}\), und daher ist die Auflösungsverbesserung in RESI unabhängig von σSMLM und erreicht Lokalisierungsgenauigkeit auf der Ångström-Skala.

Das Zentrum jeder Gruppe von Lokalisierungen kann mit einer Genauigkeit berechnet werden, die weitaus besser ist als σSMLM. Im Wesentlichen wird durch die Anwendung des Prinzips der Lokalisierungsmikroskopie auf unterscheidbare Gruppen von K superaufgelösten Lokalisierungen die Präzision vom sd (σSMLM) zum sem (\(\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}) erhöht. }}{\sqrt{K}}\)). Das Sammeln einer beliebig großen Anzahl von Lokalisierungen führt zu einer willkürlichen Steigerung der Präzision. Bemerkenswert ist, dass diese Präzisionssteigerung unabhängig von der in einzelnen Lokalisierungen erreichten Präzision (σSMLM) erfolgt.

Wir stellen eine einfache Implementierung dieses Konzepts vor, indem wir Exchange-PAINT17, eine Variante von DNA-PAINT18, für identische Zielmoleküle verwenden (Abb. 1c). DNA-PAINT nutzt die programmierbare, repetitive, aber vorübergehende Bindung von farbstoffmarkierten „Imager“-Strängen an ihre komplementären „Docking“-Stränge an Zielmolekülen von Interesse9,18. Die vorübergehende Natur der Bindung führt zu einem scheinbaren „Blinken“ des Ziels, das für die Durchführung von SMLM erforderlich ist. Exchange-PAINT verwendet orthogonale DNA-Barcodes in Kombination mit Bildgebungs- und Waschzyklen, um ein sequentielles Target-Multiplexing zu ermöglichen. In unserer Implementierung „multiplexen“ wir eine einzelne Zielart, indem wir sie in mehrere, spärlichere Teilmengen aufteilen. Indem sie nacheinander abgebildet werden, werden ausreichend beabstandete und isolierte Gruppen von Lokalisierungen gemessen. Die Bestimmung des Zentrums jeder Gruppe von Lokalisierungen führt zu einer Verbesserung der Auflösung (Abb. 1d). Wir nennen diese Umsetzung der Auflösungsverbesserung durch sequentielle Bildgebung (RESI) und die daraus resultierenden Lokalisierungen RESI-Lokalisierungen.

Durch die Anwendung von RESI in silico (Methoden) haben wir eine Auflösungsverbesserung (Extended Data Abb. 1) gegenüber der Superauflösung gezeigt, ähnlich der Verbesserung von superaufgelösten gegenüber beugungsbegrenzten Messungen (Abb. 1e). Für die routinemäßig erreichbare DNA-PAINT-Lokalisierungsgenauigkeit (ungefähr 3 nm) und die Anzahl der Lokalisierungen pro Ziel (in der Größenordnung von Hunderten) könnte RESI eine Präzision deutlich unter einem Nanometer erreichen und damit in die Ångström-Skala (Abb. 1f) gemäß \( {\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}}\).

Für einen experimentellen Beweis des Prinzips von RESI verwendeten wir selbstorganisierte DNA-Origami-Strukturen, um orthogonale DNA-Stränge präzise zu positionieren9,19. Wir haben zunächst DNA-Origami mit zwei Andocksträngen im Abstand von 5 nm entworfen, einem Abstand, der zuvor mit DNA-PAINT7,9 ermittelt wurde, um die Genauigkeit und Präzision von RESI zu überprüfen. Mit zwei aufeinanderfolgenden Bildgebungsrunden und einem Ausrichtungsverfahren (Methoden) zur Durchführung von RESI konnten wir den Punkt-zu-Punkt-Abstand von 5 nm mit einer um den Faktor \(\sqrt{{K}_{{\ rm{Durchschnitt}}}}=\sqrt{381}\ungefähr 20\) (Extended Data Abb. 2 und 3).

Als nächstes führten wir RESI in drei Dimensionen (3D) unter Verwendung kürzlich entwickelter 3D-DNA-Origami-Scheibenstrukturen20 durch und maßen Abstände zwischen Andocksträngen von 2,5 ± 0,4 nm in xy und 11,3 ± 0,8 nm in z. Dies zeigt, dass die RESI-Auflösungsverbesserung in allen drei Dimensionen funktioniert und die aktuellen hochmodernen 3D-Superauflösungsfähigkeiten übertrifft (erweiterte Daten, Abb. 4 und 5; Bildparameter siehe erweiterte Datentabelle 1).

Um die Anwendbarkeit von RESI im zellulären Kontext zu demonstrieren, haben wir als nächstes Strukturproteine ​​des Kernporenkomplexes (NPC) abgebildet. Als wichtigster Torwächter des nukleozytoplasmatischen Transports ist der NPC ein wichtiges Ziel für die Strukturbiologieforschung21. Darüber hinaus haben wir den NPC als Modellsystem ausgewählt, weil er mit einer Vielzahl von Bildgebungsansätzen gut untersucht wurde, darunter Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)22, Fluoreszenzmikroskopie und hochauflösende Techniken23,24. Abbildung 2a zeigt ein typisches beugungsbegrenztes und DNA-PAINT-Bild von Nup96-Molekülen (markiert mit monomerem verstärktem grün fluoreszierendem Protein (mEGFP)), markiert mit DNA-konjugierten Anti-GFP-Nanokörpern. Nup96 ist ein strukturelles NPC-Protein (Teil des sogenannten Y-Komplexes), das in acht Paaren vorhanden ist und eine achtfache Symmetrie sowohl auf dem Zytoplasma- als auch auf dem Kernring aufweist, was insgesamt 32 Kopien pro NPC ergibt (Abb. 2b). Einzelne Paare von Nup96-Proteinen, die etwa 10 nm seitlich und 3 nm axial beabstandet sind, können mit aktuellen, hochmodernen Superauflösungsimplementierungen nicht routinemäßig aufgelöst werden25,26,27,28. Um RESI zu ermöglichen, müssen benachbarte Kopien von Nup96-Proteinen mit orthogonalen DNA-Sequenzen markiert werden. Zu diesem Zweck entschieden wir uns für einen stochastischen Markierungsansatz, indem wir die Probe mit Anti-GFP-Nanokörpern inkubierten, die jeweils mit einer von vier orthogonalen Sequenzen konjugiert waren (Abb. 2c). Wir stellen fest, dass mit einer zunehmenden Anzahl erwarteter Ziele unterhalb der klassischen DNA-PAINT-Auflösungsgrenze eine größere Anzahl orthogonaler Markierungssequenzen29 – und damit Bildgebungsrunden – erforderlich ist, um ausreichend beabstandete Gruppen von Lokalisierungen zu gewährleisten (Einzelheiten zu dieser Anforderung finden Sie unter Methoden). ). Die sequentielle 3D-Bildaufnahme in vier Runden führte zu ausreichend beabstandeten Lokalisierungsgruppen, die einzelne Nup96-Zielmoleküle repräsentierten (Abb. 2d). Die anschließende RESI-Superlokalisierung dieser Gruppen ermöglichte uns die routinemäßige Visualisierung einzelner Kopien von Nup96-Proteinen (Abb. 2e). Wir stellen fest, dass dies über das gesamte Sichtfeld (ungefähr 67 × 67 µm2) mit insgesamt über 1.000 NPCs während einer Gesamtbildaufnahmezeit von 100 Minuten erreicht wurde (repräsentative Daten finden Sie in Abb. 6 der erweiterten Daten). Das rekonstruierte RESI-Bild weist eine durchschnittliche laterale Lokalisierungsgenauigkeit von etwa 1 nm auf, was einer sechsfachen Verbesserung gegenüber den einzelnen DNA-PAINT-Erfassungsrunden entspricht. Wir erreichten daher eine durch die Markierungsgröße begrenzte Auflösung, die es uns ermöglichte, einzelne Nup96-Moleküle aufzulösen (Abb. 2f). Im Allgemeinen schränkt die Etikettengröße nicht nur die räumliche Auflösung ein, sondern kann darüber hinaus zu Ungenauigkeiten wie verzerrten beobachteten Entfernungen aufgrund von Verknüpfungsfehlern führen.

a, beugungsbegrenztes und DNA-PAINT-Übersichtsbild von Nup96-mEGFP, markiert mit DNA-konjugierten Anti-GFP-Nanokörpern. Die vergrößerte Ansicht (unten rechts) zeigt eine hohe Markierungseffizienz und Bildqualität für Standard-DNA-PAINT-Bedingungen und rekapituliert die achtfache Symmetrie des NPC. b, Kryo-EM-Strukturdarstellung der Position von Nup96-Proteinen (rot; C-terminale mEGFP-Position blau markiert) als Teil des Y-Komplexes in Kern- und Zytoplasmaringen (NR bzw. CR). Angepasst von PDB 7PEQ. Nup96 ist in 32 Kopien pro NPC vorhanden. c: Um RESI zu ermöglichen, wurden Nup96-mEGFP-Proteine ​​stochastisch mit orthogonalen DNA-Sequenzen markiert, indem die Probe mit Anti-GFP-Nanokörpern inkubiert wurde, die jeweils mit einer von vier orthogonalen Sequenzen konjugiert waren (dargestellt durch blaue, gelbe, magentafarbene und grüne Punkte). d: Sequentielle 3D-Bildgebung (Farbe stellt Z-Position dar) der vier Markierungen ergab ausreichend beabstandete Lokalisierungsverteilungen. Die durchschnittliche Anzahl der Lokalisierungen pro Ziel beträgt Kaverage = 38 (Hintergrund stellt Kryo-EM-Struktur aus b für den Kontext dar). e, Vergleich von 3D DNA-PAINT (oben links) und 3D RESI (unten rechts) für denselben NPC, der die Verbesserung der räumlichen Auflösung durch RESI veranschaulicht. Lokalisierungen werden als Gaußsche Werte mit σDNA-PAINT bzw. σRESI gerendert. f: Eine Lokalisierungsgenauigkeit (σRESI) von bis zu 5 Å wurde durch die Kombination von K-Lokalisierungen für jedes Ziel erreicht, wodurch einzelne Nup96-Proteine ​​eindeutig aufgelöst wurden. g: Die 3D-NPC-Kryo-EM-Struktur wurde mithilfe optischer Mikroskopie rekapituliert, indem ein modellfreier Durchschnitt30 von 1.217 NPCs aus einem einzelnen Kern angewendet wurde. h, RESI löste benachbartes Nup96 in einem Strukturmittel durch optische Mikroskopie auf. i, In Übereinstimmung mit der Kryo-EM-Struktur (unter Berücksichtigung des Verknüpfungsfehlers aufgrund der Markierungsgröße) waren benachbarte Nup96-Proteine ​​seitlich 11,9 ± 1,2 nm voneinander entfernt (oben) und axial 5,4 ± 0,4 nm (unten).

Anschließend führten wir eine unvoreingenommene 3D-Mittelung von 1.217 NPCs durch, wobei wir einen kürzlich entwickelten modellfreien Ansatz für SMLM-Daten verwendeten30. Der resultierende 3D-Durchschnitt (Abb. 2g) ermöglicht nicht nur die Rekapitulation der achtfachen Symmetrie von Nup96 sowohl im Zytoplasma als auch im Kernring (was zuvor mit Superauflösung erreicht wurde23,24,25,26,27,28), sondern auch ermöglicht die Auflösung einzelner Nup96-Proteine ​​im Strukturmittel (Abb. 2h). Dank der beispiellosen räumlichen Auflösung von RESI konnten wir Abstände von Nup96-Proteinen von 11,9 ± 1,2 nm seitlich und 5,4 ± 0,4 nm axial aus dem strukturellen Durchschnittsbild rekapitulieren (Abb. 2i). Sowohl die laterale als auch die axiale Ausrichtung sowie die Neigung der Nup96-Paare stimmen mit Kryo-EM-Daten überein22. Wir haben diese räumliche Anordnung für die meisten Nup96-Proteinpaare gelöst (Extended Data Abb. 7), die bisher für die optische Mikroskopie unerreichbar war.

Um die letztendlich mit RESI erreichbare räumliche Auflösung zu testen, haben wir eine flache, rechteckige DNA-Origami-Struktur mit sechs Paaren (im Abstand von 20 nm) direkt benachbarter orthogonaler Docking-Stränge im Abstand von nur einem DNA-Basenpaar entworfen (rote und blaue Stränge in Abb . 3a). Dies ergab einen geplanten Abstand in der Ebene von etwa 7 Å entlang des Rückgrats eines Strangs der DNA-Doppelhelix31. Die Strukturen enthalten außerdem DNA-PAINT-Andockstränge zur präzisen Ausrichtung zwischen aufeinanderfolgenden Bildgebungsrunden (grüne Stränge in Abb. 3a). Die hochmoderne DNA-PAINT-Bildaufnahme32 mit einer räumlichen Auflösung von etwa 5 nm ergab sechs Lokalisierungswolken in einer 20-nm-Rasteranordnung, konnte jedoch die einzelnen Andockstränge bei Abständen einzelner Basenpaare im Subnanometerbereich nicht auflösen (Abb. 3b).

a, DNA-Origami mit Andocksträngen, die durch ein einzelnes Basenpaar (bp; rote und blaue Stränge, mit Ausrichtungsmarkierungen in Grün) voneinander getrennt sind, bot eine Plattform, um die höchste mit RESI erreichbare Auflösung zu demonstrieren. b: DNA-PAINT löste einen Abstand von 20 nm auf, aber die Auflösung reichte nicht aus, um einzelne Andockstellen im Abstand von einer Base zu unterscheiden. c, RESI löst die benachbarten Docking-Stränge auf. d: Aus einzelnen Lokalisierungen wurde ein euklidischer Abstand von 8,5 ± 1,7 Å mit einer durchschnittlichen Genauigkeit von 1,2 Å (links) für den Einzelbasenpaar-Rückgratabstand berechnet, der innerhalb von 1 sd vom erwarteten Wert von etwa 7 Å liegt (rechts). ). e, die experimentelle Lokalisierungsgenauigkeit in RESI stimmt gut mit \(\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}}\) (blaue Linie, K) überein, was eine ergibt durchschnittliche Lokalisierungsgenauigkeit von 1,3 Å für die experimentellen Daten von allen n = 42 DNA-Origami (Einschübe entsprechen dem beispielhaften Punktpaar in d). Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± 1 Standardabweichung dar

Bemerkenswerterweise löst RESI die einzelnen Docking-Strangpositionen (Abb. 3c) in allen DNA-Origami-Strukturen auf. Wir stellen fest, dass RESI dies in einer Bildaufnahmezeit von 100 Minuten mit einem etwa 67 × 67 μm2 großen Sichtfeld mit mehr als 2.000 DNA-Origami-Strukturen erreichte (siehe Extended Data Abb. 8 für repräsentative DNA-Origami-Strukturen). Mit RESI können wir routinemäßig Stränge auflösen, die nur durch ein DNA-Basenpaar voneinander getrennt sind. Bemerkenswerterweise haben wir einen Abstand von 8,5 ± 1,7 Å zwischen zwei einzelnen Andocksträngen in einer einzelnen DNA-Origami-Struktur gemessen (Abb. 3d). Dies zeigt eine beispiellose Auflösung in der optischen Mikroskopie durch die Unterscheidung von Strukturen, die näher als ein Nanometer sind. Wir stellen fest, dass unser Auflösungsanspruch auf der grundlegendsten und strengsten Definition basiert: der Fähigkeit, Punktobjekte räumlich zu unterscheiden. Wir haben einen Abstand von 9,5 ± 2,6 Å zwischen benachbarten Andocksträngen in durchschnittlich 42 DNA-Origami gemessen (Extended Data Abb. 9), was innerhalb von 1 sd des erwarteten Rückgratabstands31 von etwa 7 Å liegt.

Um den Auflösungsgewinn zu quantifizieren, haben wir RESI-Lokalisierungen für verschiedene K-Werte berechnet, die den DNA-PAINT-Lokalisierungen zugrunde liegen (Methoden). Wir zeigen, dass die effektive Lokalisierungsgenauigkeit wie folgt skaliert: }\), was eine durchschnittliche Lokalisierungsgenauigkeit von 1,3 Å für einen durchschnittlichen K = 254 ergibt (Abb. 3e), was die In-silico-Ergebnisse experimentell bestätigt (Abb. 1f). RESI ermöglicht nicht nur eine praktisch unbegrenzte Anzahl von Lokalisierungen pro Ziel, sondern vermeidet auch schädliche photophysikalische Effekte, die durch die räumliche Nähe fester Farbstoffmarkierungen verursacht werden, da bei der DNA-PAINT-Bildgebung niemals zwei benachbarte Farbstoffe gleichzeitig vorhanden sind. Kürzlich wurde berichtet33, dass photophysikalische Nahfeldwechselwirkungen bei Abständen unter 10 nm eine wichtige Rolle bei der Modulation der Photoschaltkinetik spielen und somit den Zugriff von Festfarbstoff-SMLM-Techniken auf diese Auflösungsskala effektiv verhindern. Dies begrenzt letztendlich die erreichbare Auflösung selbst der photoneneffizientesten Techniken zur Einzelmoleküllokalisierung, wie MINFLUX oder MINSTED, trotz ihrer Subnanometer-Präzision, sofern sie nicht mit DNA-PAINT kombiniert werden. Die experimentell nachgewiesene Auflösung im Subnanometerbereich verdeutlicht die Fähigkeit von RESI, strukturbiologische Studien mithilfe von DNA-basierter Bildgebung in bisher schwer fassbaren Maßstäben zu ermöglichen.

Schließlich haben wir RESI angewendet, um eine derzeit diskutierte zellbiologische Frage anzugehen und zu lösen, die bisher sowohl für Kryo-EM in einem nativen zellulären Kontext als auch für etablierte Super-Resolution-Techniken unerreichbar war. Insbesondere untersuchten wir die Organisation von CD20-Membranrezeptoren, die Hauptziele für die therapeutische Antikörperbehandlung von B-Zell-Blutkrebs und Autoimmunerkrankungen sind34.

Im Fall des am häufigsten verwendeten therapeutischen Anti-CD20-Antikörpers, Rituximab (RTX), wird angenommen, dass die räumliche Neuanordnung von CD20 in der Zellmembran eine wichtige Rolle für seine Wirksamkeit spielt35,36. In jüngsten Kryo-EM-Studien wurde CD20 als Dimer im Komplex mit zwei einzelnen RTX-Fragment-Antigen-Bindungsregionen nachgewiesen37,38, was auf eine lineare kettenartige Anordnung von CD20 in Gegenwart des vollständigen Antikörpers hindeutet38. Andererseits wurde bei Inkubation mit dem vollständigen RTX-Antikörper in EM-Bildern ein trimerer Ring aus abwechselnden RTX-Molekülen und CD20-Dimeren nachgewiesen37. Die Tatsache, dass Kryo-EM-Experimente in Waschmittellösung durchgeführt werden, wirft die Frage auf, welche molekularen Anordnungen tatsächlich in der Zelle vorliegen. Derzeit kann die Organisation von CD20 bei Bindung an vollständige RTX-Antikörper in intakten Zellen nicht beurteilt werden, sodass die Untersuchung, ob CD20-Cluster linearer oder zirkulärer Natur sind, ausgeschlossen ist. Obwohl In-vitro-Studien zeigten, dass sich CD20-Dimere ohne Antikörperbindung bilden können, ist die quantitative Bewertung der CD20-Dimerisierung in unbehandelten Zellen derzeit begrenzt.

Hier verwendeten wir RESI, um die molekulare Anordnung von CD20 in Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) zu untersuchen, die vorübergehend mit mEGFP-CD20 transfiziert wurden, wobei wir vier Runden Sondenaustausch in einer Gesamtbildgebungszeit von 4,4 Stunden verwendeten. Im beugungsbegrenzten Überblick und im hochauflösenden DNA-PAINT-Bild unbehandelter Zellen erschien CD20 homogen verteilt (Abb. 4a, b (oben) und erweiterte Daten Abb. 10a), wohingegen RTX-behandelte Zellen offensichtliche CD20-Cluster aufwiesen (Abb. 4b (unten) und Extended Data Abb. 11a und 12a).

a, beugungsbegrenztes und DNA-PAINT-Übersichtsbild von CHO-Zellen, die mit Anti-GFP-Nanokörpern markiertes mEGFP-CD20 exprimieren. b, Vergrößertes DNA-PAINT-Bild, das scheinbar zufällig verteilte CD20-Rezeptoren für unbehandelte Zellen (oben) und eine geclusterte Rezeptoranordnung für RTX-behandelte Zellen (unten) zeigt. c, Vergleich von DNA-PAINT und RESI für unbehandelte und RTX-behandelte Zellen, die in den RESI-Bildern Rezeptorpaare mit einem Abstand von weniger als 10 nm zeigen, die mit DNA-PAINT nicht auflösbar sind. d, RESI-Daten legen nahe, dass CD20-Proteine ​​in Dimeren (im Abstand von ddimer) vorkommen, die wiederum gemäß vollständiger räumlicher Zufälligkeit (CSR; Abstände zwischen Dimeren, dCSR) in unbehandelten Zellen verteilt sind. Nach der Verabreichung von RTX wurden Dimerketten beobachtet. e, Ganzzellanalyse der ersten NNDs von CD20-Rezeptoren (Histogramme der Abstände und Kerndichteschätzung werden angezeigt). Nur RESI, nicht jedoch DNA-PAINT, ermöglicht die routinemäßige Erkennung von Abständen unter 10 nm zwischen Proteinen. Während DNA-PAINT den Dimerabstand überschätzt, zeigt RESI einen markierungsbegrenzten Abstand von 13,5 nm (Diskussion siehe Haupttext). f, Die Anpassung der RESI-NND-Daten von e an ein numerisches Modell zeigt CD20-Dimere und -Monomere. g, CD20-Rezeptoren in unbehandelten Zellen zeigten zweite bis vierte NNDs, die mit CSR übereinstimmten, wodurch das Vorhandensein von Proteinkomplexen höherer Ordnung ausgeschlossen wurde. h, CD20-Rezeptoren in RTX-behandelten Zellen zeigten jedoch erste bis vierte NNDs, was nicht mit einer vollständigen räumlichen Zufälligkeit vereinbar ist.

Der Vergleich von DNA-PAINT und RESI für unbehandelte und RTX-behandelte Zellen zeigt CD20-Paare mit einem Abstand von weniger als 10 nm in den RESI-Bildern (Abb. 4c, rechts), die mit DNA-PAINT nicht auflösbar waren (Abb. 4c, links). . RESI-Bilder legen nahe, dass CD20 in unbehandelten bzw. RTX-behandelten Zellen in Dimeren und kettenartigen Strukturen höherer Ordnung vorhanden ist (Abb. 4d).

Um das Vorhandensein von Dimeren in unbehandelten Zellen quantitativ zu beurteilen, führten wir eine erste NND-Analyse (Nearest Neighbor Distance) sowohl für DNA-PAINT- als auch für RESI-Daten durch und zeigten in beiden Fällen nicht zufällige Verteilungen (Abb. 4e). RESI mit einer Lokalisierungsgenauigkeit von 1 nm zeigt einen erheblichen Anteil von Abständen unter 10 nm im NND-Histogramm, was eine quantitative Bewertung des CD20-Dimerisierungsgrads ermöglicht. Wir führten numerische Simulationen und eine Anpassung der kleinsten Quadrate (Methoden) durch, die eine Zusammensetzung von 53 ± 1 % Monomeren und 47 ± 1 % Dimeren mit einem durchschnittlichen Intradimerabstand von 13,5 ± 0,3 nm ergaben (Abb. 4f, durchgezogene Linie). Zum Vergleich haben wir NND-Verteilungen simuliert, die einer Population von 100 % Monomeren entsprechen (Abb. 4f, gepunktete Linie), was weiter zeigt, dass CD20-Moleküle nicht ausschließlich als Monomere vorliegen. Da alle NND-Verteilungen mit Ausnahme der ersten Ordnung mit einer vollständigen räumlichen Zufallsverteilung (CSR) bei der experimentell gemessenen Dichte übereinstimmen, schließen wir das Vorhandensein von Anordnungen höherer Ordnung für unbehandeltes CD20 aus (Abb. 4g). Unsere Ergebnisse liefern quantitative experimentelle Beweise dafür, dass CD20 als Dimere in einer intakten Zellmembran vorliegt.

Im Gegensatz dazu ergab die RESI-Analyse von CD20 in RTX-behandelten Zellen erste bis vierte NND-Verteilungen, die nicht mit einem CSR-Modell übereinstimmten (Abb. 4h und erweiterte Daten Abb. 12d, e). Dies deutet auf eine Anordnung höherer Ordnung von CD20-Molekülen nach der RTX-Behandlung hin und bestätigt aktuelle, von Kryo-EM abgeleitete Modelle37,38.

Schließlich untersuchten wir die Existenz hexamerer, ringförmiger Anordnungen durch Vergleich mit numerischen Simulationen (Extended Data Abb. 13). Die Eigenschaften der experimentell nachgewiesenen CD20-Cluster lassen auf das Fehlen isolierter Hexamere schließen und stützen die Hypothese überwiegend linearer, kettenartiger Strukturen (Extended Data Abb. 13h).

Wir stellen RESI vor, einen konzeptionell neuen Ansatz im SMLM zur Verbesserung der räumlichen Auflösung der optischen Mikroskopie auf die Ångström-Skala. RESI erreicht dies durch die Kombination mehrerer Lokalisierungen von einzelnen Zielen, um ein „Super-Super-Resolution“-Bild zu erhalten, nachdem ihre Lokalisierungen durch sequentielle Bildgebung (z. B. mithilfe von DNA-Barcode-Sonden) getrennt wurden.

Auf diese Weise skaliert die RESI-Präzision – und damit die Auflösung – nicht nur mit der Anzahl der pro Lokalisierung erfassten Photonen (N), sondern auch mit der Anzahl der pro Ziel erfassten Lokalisierungen (K). RESI liefert somit ein neues Präzisionsskalierungsgesetz: \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K} }\ approx \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{K}\sqrt{N}}\). Dies gilt, wenn eine ausreichend große Anzahl orthogonaler Markierungssequenzen und damit Bildrunden ausreichend beabstandete Gruppen von Lokalisierungen gewährleisten (Extended Data Abb. 14). Wichtig ist, dass die Auflösungsverbesserung in drei Dimensionen isotrop ist. Für unsere aktuelle experimentelle Implementierung nähert sich RESI der Auflösung der Strukturbiologie mit einem rein optischen Ansatz in intakten Zellen unter Verwendung handelsüblicher Markierungsreagenzien und eines einfachen inversen Fluoreszenzmikroskops, das unter Umgebungsbedingungen betrieben wird. Wir konnten experimentell eine räumliche Auflösung von Ångström unterhalb der physikalischen Größe eines Farbstoffs nachweisen. Dies wurde durch drei spezifische Vorteile von DNA-PAINT erreicht, die zu einer unvoreingenommenen Zielprobenahme führen: (1) die Rotationsflexibilität des zielgebundenen Andockstrangs (selbst im Fall längerer Wiederholungssequenzmotive 32); (2) der frei rotierende Dipol des Farbstoffs, der an der Imager-Sequenz angebracht ist; und (3) die Tatsache, dass zwei benachbarte Bildgeber niemals gleichzeitig vorhanden sind.

Da RESI-Bilder außerdem nicht aus einzelnen Lokalisierungen, sondern aus Gruppen von Lokalisierungen pro Ziel gewonnen werden, weist die Methode im Vergleich zu anderen SMLM-Techniken ein einzigartig robustes Merkmal auf: Sie verlagert den Schwerpunkt von der Verbesserung nur der optischen Präzision (σOPT) auf die Verbesserung der Gesamtpräzision (\({\sigma }_{{\rm{SMLM}}}\ approx \sqrt{{{\sigma }_{{\rm{OPT}}}}^{2}+{{\sigma }_{ {\rm{MEC}}}}^{2}}\)) durch Mittelung der Unsicherheitseffekte der mechanischen Instabilität (σMEC), sofern diese normalverteilt ist.

Mit RESI haben wir in 100 Minuten Flächen von 67 × 67 μm2 gemessen, was es zu einem ausreichend hohen Durchsatzwerkzeug für die Zellbiologie macht. Die Auflösung von Rezeptormustern mit Einzelproteinauflösung könnte eine „räumliche Diagnostik“ als Vorscreening-Methode für personalisierte Behandlungen ermöglichen und als Werkzeug für die biomedizinische Entdeckung strukturierter Therapeutika dienen – beispielsweise durch die Orientierung an Prinzipien des Arzneimitteldesigns.

Die Leistung und Genauigkeit von RESI könnte durch Fortschritte bei intramolekularen Markierungsansätzen wie orthogonalen nichtnatürlichen Aminosäuren weiter verbessert werden39. Damit ist RESI in der Lage, die Lücke zwischen hochauflösender 3D-Fluoreszenzmikroskopie in ganzen intakten Zellen und Kryo-EM-Strukturstudien einzelner supramolekularer Komplexe zu schließen und einen Paradigmenwechsel in der Fluoreszenzbildgebung einzuleiten, indem die optische Mikroskopie auf Ångström-Auflösungen gebracht wird.

Unmodifizierte DNA-Oligonukleotide sowie mit C3-Azid und Cy3B modifizierte DNA-Oligonukleotide wurden von MWG Eurofins und Metabion gekauft. Das M13mp18- und p7560-Gerüst wurde von Tilibit bezogen. Magnesiumchlorid (1 M, Nr. AM9530G), Natriumchlorid (5 M, Nr. AM9759), Reinstwasser (Nr. 10977-035), Tris (1 M, pH 8,0, Nr. AM9855G), EDTA (0,5 M, pH 8,0, Nr. AM9260G) und 10× PBS (Nr. 70011051) wurden von Thermo Fisher Scientific bezogen. BSA (Nr. A4503-10G) wurde bei Sigma-Aldrich bestellt. Triton X-100 (Nr. 6683.1) wurde von Carl Roth gekauft. Natriumhydroxid (Nr. 31627.290) wurde von VWR bezogen. Paraformaldehyd (Nr. 15710) und Glutaraldehyd (Nr. 16220) wurden von Electron Microscopy Sciences bezogen. Tween-20 (Nr. P9416-50ML), Glycerin (Nr. 65516-500 ml), Methanol (Nr. 32213-2,5L), Protocatechuat 3,4-Dioxygenase Pseudomonas (PCD, Nr. P8279), 3,4- Dihydroxybenzoesäure (PCA, Nr. 37580-25G-F) und (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox, Nr. 238813-5G) wurden bei bestellt Sigma-Aldrich. Neutravidin (Nr. 31000) wurde von Thermo Fisher Scientific bezogen. Biotin-markiertes BSA (Nr. A8549) und Natriumazid (Nr. 769320) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Deckgläser (Nr. 0107032) und Glasobjektträger (Nr. 10756991) wurden von Marienfeld bzw. Thermo Fisher Scientific gekauft. Fetales Rinderserum (FBS, Nr. 10500-064), 1× PBS (pH 7,2, Nr. 20012-019), 0,05 % Trypsin-EDTA (Nr. 25300-054), Lachssperma-DNA (Nr. 15632011), OptiMEM (Nr. 31985062) und Lipofectamine LTX (Nr. A12621) wurden von Thermo Fisher Scientific bezogen. Goldnanopartikel (90 nm, Nr. G-90-100) wurden bei Cytodiagnostics bestellt. Nanokörper gegen GFP (Klon 1H1) mit einem einzelnen ektopischen Cystein am C-Terminus zur ortsspezifischen Konjugation wurden von Nanotag Biotechnologies erworben. DBCO-PEG4-Maleimid (Nr. CLK-A108P) wurde von Jena Bioscience bezogen.

Die folgenden Puffer wurden zur Probenvorbereitung und Bildgebung verwendet.

Puffer A: 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl und 0,05 % Tween-20

Puffer B: 10 mM MgCl2, 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA und 0,05 % Tween-20 pH 8,0

Puffer C: 1× PBS, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl pH 7,4, 0,02 % Tween, optional ergänzt mit 1× Trolox, 1× PCA und 1× PCD

Blockierungspuffer: 1× PBS, 1 mM EDTA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % NaN3, 2 % BSA, 0,05 mg ml–1 gescherte Lachssperma-DNA

Zweidimensionaler (2D) DNA-Origami-Faltungspuffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl2 pH 8,0

3D-DNA-Origami-Faltungspuffer: 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2 pH 8,0

1× TA-Puffer: 40 mM Tris pH 8,0, 20 mM Essigsäure

Trolox (100x) wurde durch Zugabe von 100 mg Trolox zu 430 μl 100 % Methanol und 345 μl 1 M NaOH in 3,2 ml Wasser hergestellt. PCA (40x) wurde durch Mischen von 154 mg PCA in 10 ml Wasser und NaOH und Einstellen des pH-Werts auf 9,0 hergestellt. PCD (100x) wurde durch Zugabe von 9,3 mg PCD zu 13,3 ml Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 50 % Glycerin) hergestellt.

Vier orthogonale DNA-Sequenzmotive wurden zur Markierung von Zielen in vier RESI-Runden verwendet. Die Andockstränge waren 5xR1 (TCCTCCTCCTCCTCCTCCT), 5xR2 (ACCACCACCACCACCACCA), 7xR3 (CTCTCTCTCTCTCTCTCTC) und 7xR4 (ACACACACACACACACACA). Die jeweiligen Imager waren R1 (AGGAGGA-Cy3B), R2 (TGGTGGT-Cy3B), R3 (GAGAGAG-Cy3B) und R4 (TGTGTGT-Cy3B). Das Design von 2D-RESI-Origami erforderte eine Erweiterung der R1-Stelle am 5′-Ende, sodass die benachbarten Andockstränge R1 und R3 durch ein einzelnes Basenpaar voneinander beabstandet sein konnten. Daher wurden für beide 2D-DNA-Origamis der Docking-Strang 5‘ 5xR1 (TCCTCCTCCTCCTCCTCCT) und der 5‘ R1-Imager (Cy3B-AGGAGGA) anstelle der 3‘-Versionen verwendet.

Alle 2D-DNA-Origami-Strukturen wurden in caDNAno40 entworfen. Die Selbstorganisation von DNA-Origami wurde in einem Eintopf-Reaktionsgemisch mit einem Gesamtvolumen von 40 μl erreicht, bestehend aus 10 nM Gerüststrang (Sequenz siehe ergänzende Daten 2), 100 nM Faltklammern (ergänzende Daten 1), 500 nM biotinylierte Klammern (Ergänzende Daten 1) und 1 μM Klammerstränge mit Andockstellenverlängerungen (Ergänzende Daten 1) in 2D-DNA-Origami-Faltpuffer. Anschließend wurde die Reaktionsmischung mit einem Thermocycler einer thermischen Temperrampe unterzogen. Zunächst wurde es 5 Minuten lang bei 80 °C inkubiert, mit einem Temperaturgradienten von 60 auf 4 °C in Schritten von 1 °C pro 3,21 Minuten abgekühlt und schließlich bei 4 °C gehalten.

Die 3D-DNA-Origami-Scheibenstruktur wurde in caDNAno40 entworfen. Die Selbstorganisation der DNA-Origami-Scheibe wurde in einem Eintopf-Reaktionsgemisch mit einem Gesamtvolumen von 50 µl, bestehend aus 20 nM Gerüststrang p7560 (Sequenz siehe ergänzende Daten 3), 200 nM Kernfaltklammern (ergänzende Daten 1) erreicht. , 200 nM Klammersequenzen ohne Griffverlängerung (Ergänzende Daten 1), 500 nM biotinylierte Klammern (Ergänzende Daten 1), 2 μM Klammerstränge mit R4-Andockstellenerweiterungen und 4 μM Klammerstränge mit R1- oder R3-Andockstellenerweiterungen (Ergänzende Daten 1) im 3D-DNA-Origami-Faltungspuffer. Anschließend wurde die Reaktionsmischung mit einem Thermocycler einer thermischen Temperrampe unterzogen. Es wurde zunächst 5 Minuten lang bei 80 °C inkubiert, dann mit einem Temperaturgradienten von 60 °C auf 20 °C in Schritten von 1 °C pro Stunde abgekühlt und schließlich bei 20 °C gehalten.

Nach der Selbstorganisation wurden die Strukturen durch Agarosegelelektrophorese (1,5 % Agarose, 1× TA, 10 mM MgCl2, 0,5× SybrSafe) bei 4,5 V cm–1 für 1,5 Stunden gereinigt. Gelbänder wurden geschnitten, zerkleinert und das Origami in Eppendorf-Röhrchen mit geringer Bindung bei –20 °C gelagert.

Zur Probenvorbereitung wurde ein bodenloser Sechskanalobjektträger (ibidi, Nr. 80608) auf einem Deckglas befestigt. Zunächst wurden 80 μl Biotin-markiertes BSA (1 mg ml–1, gelöst in Puffer A) in die Kammer gespült und 5 Minuten lang inkubiert. Die Kammer wurde dann mit 360 μl Puffer A gewaschen. Ein Volumen von 100 μl Neutravidin (0,1 mg ml–1, gelöst in Puffer A) wurde dann in die Kammer gespült und 5 Minuten lang binden gelassen. Nach dem Waschen mit 180 μl Puffer A und anschließend mit 360 μl Puffer B wurden 80 μl Biotin-markierte DNA-Strukturen (ca. 200 pM) in Puffer B in die Kammer gespült und 5 Minuten lang inkubiert. Zur Messung der DNA-Origami-Scheibe wurden zusätzliche 2D-DNA-Origami-Strukturen mit 12 Zielstellen9 im Abstand von 20 nm zusammen inkubiert, wobei die 3D-Scheiben-Origami als Bezugspunkte für die Driftkorrektur dienten. Nach der DNA-Origami-Inkubation wurde die Kammer mit 540 μl Puffer B gewaschen. Für DNA-Origami-Scheibenstrukturen wurden 150 μl Goldnanopartikel (1:10 in Puffer B verdünnt) durchgespült und 5 Minuten lang inkubiert, bevor mit 540 μl Puffer gewaschen wurde B. Abschließend wurden 180 μl der Imager-Lösung in Puffer B in die Kammer gespült. Die Kammer blieb mit Bildgebungslösung gefüllt und anschließend wurde eine Bildgebung durchgeführt. Zwischen den Bildgebungsrunden wurde die Probe dreimal mit 1 ml Puffer B gewaschen, bis kein Restsignal von der vorherigen Bildgebungslösung mehr erkannt wurde. Dann wurde die nächste Imager-Lösung eingeführt. Für RESI wurden zwei Bildgebungsrunden durchgeführt, wobei in Runde 1 die Bildgeber R1 und R4 und in Runde 2 die Bildgeber R3 und R4 vorhanden waren (R1 und R3 sondieren die für RESI interessanten Stellen, und R4 dient der Ausrichtung).

Nanokörper wurden wie zuvor beschrieben konjugiert32. Nicht konjugierte Nanokörper wurden auf Eis aufgetaut, dann wurde ein 20-facher molarer Überschuss an bifunktionellem DBCO-PEG4-Maleimid-Linker hinzugefügt und 2 Stunden lang auf Eis umgesetzt. Nicht umgesetzter Linker wurde durch Pufferaustausch zu PBS unter Verwendung von Amicon-Zentrifugalfiltern (10.000 MWCO) entfernt. Die DBCO-modifizierten Nanokörper wurden mit einem 5-fachen molaren Überschuss an Azid-funktionalisierter DNA (R1, R2, R3 und R4) über Nacht bei 4 °C umgesetzt. Nicht konjugiertes Protein und freie DNA wurden durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines ÄKTA pure-Systems, ausgestattet mit einer Resource Q 1 ml-Säule, entfernt.

CHO-Zellen (CCL-61, ATCC) wurden in Gibco Hams F-12K-Medium (Kaighn's), ergänzt mit 10 % FBS (Nr. 11573397, Gibco), kultiviert. U2OS-CRISPR-Nup96-mEGFP-Zellen (ein Geschenk der Laboratorien Ries und Ellenberg) wurden in McCoys 5A-Medium (Thermo Fisher Scientific, Nr. 16600082), ergänzt mit 10 % FBS, kultiviert. Die Zellen wurden alle 2–3 Tage mit Trypsin-EDTA passagiert.

U2OS-CRISPR-Nup96-mEGFP-Zellen wurden in ibidi-Glasbodenkammern mit acht Vertiefungen und hohem Glasboden (Nr. 80807) in einer Dichte von 30.000 cm–2 ausgesät. Die Zellen wurden mit 2,4 % Paraformaldehyd in PBS 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Goldnanopartikel (200 μl) wurden 5 Minuten lang inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen. Blockierung und Permeabilisierung wurden mit 0,25 % Triton X-100 in Blockierungspuffer für 90 Minuten durchgeführt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen 60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 100 nM Anti-GFP-Nanokörpern in Blockierungspuffer inkubiert. Um RESI zu ermöglichen, bestand die Nanokörperlösung aus 25 nM R1-, R2-, R3- und R4-Andockstrang-gekoppelten Anti-GFP-Nanokörpern mit einer gesamten Nanokörperkonzentration von 100 nM. Ungebundene Nanokörper wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS und anschließendes einmaliges Waschen mit Puffer C für 10 Minuten entfernt. Die Nachfixierung erfolgte mit 2,4 % Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde die Imager-Lösung in Puffer C in die Kammer gespült. Zwischen den Bildgebungsrunden wurde die Probe mit 1–2 ml PBS gewaschen, bis kein Restsignal von der vorherigen Bildgebungslösung mehr erkannt wurde. Dann wurde die nächste Imager-Lösung eingeführt. Zunächst wurden die Imager R1, R2, R3 und R4 gleichzeitig zur Probe hinzugefügt, um eine Standard-DNA-PAINT-Messung durchzuführen; Anschließend wurde die RESI-Bildgebung über vier aufeinanderfolgende Bildgebungsrunden mit nur einem der Bildgeber durchgeführt.

mEGFP-Alfa-CD20 wurde durch Insertion von Alfa-CD20 in das mEGFP-C1-Plasmid (Nr. 54759, Addgene) kloniert. Ein Alfa-CD20-gblock (erhalten von Integrated DNA Technologies) wurde mit den Primern cggcatggacgagct und gtacaagtccgga amplifiziert und nach dem Schneiden mit den Restriktionsenzymen BsrGI und BamHI wurde die Gibson-Assemblierung durchgeführt (2× Mix, NEB).

CHO-Zellen wurden am Tag vor der Transfektion in einer Dichte von 15.000 cm–2 in ibidi-Kammern mit acht Vertiefungen und hohem Glasboden (Nr. 80807) ausgesät. Die Transfektion mit mEGFP-CD20 wurde mit Lipofectamine LTX gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. CHO-Zellen durften 16–24 Stunden lang mEGFP-CD20 exprimieren. Dann wurde das Medium durch frisches F-12K-Medium + 10 % FBS (im unbehandelten Fall) oder durch F-12K-Medium + 10 % FBS + 10 µg ml–1 RTX-Alexa 647 (ein Geschenk von Roche Glycart) ersetzt ( im RTX-behandelten Fall), gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation. Nach zweimaligem Waschen mit frischem Medium für 5 Minuten wurden die Zellen 15 Minuten lang mit 250 µl vorgewärmtem 4 % PFA + 0,1 % Glutaraldehyd in PBS fixiert. CHO-Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und 5 Minuten lang mit 100 mM Tris, pH 8,0, gequencht. Die Permeabilisierung wurde 5 Minuten lang mit 0,2 % Triton X-100 in PBS durchgeführt, gefolgt von drei Wäschen mit PBS. Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (RT) in Blockierungspuffer blockiert. Anti-GFP-Nanokörper wurden über Nacht bei 4 °C in einer Gesamtkonzentration von 25 nM inkubiert; für RESI mit vier Runden ergab dies jeweils 6,25 nM GFP-Nb-R1/2/3/4. Nach dreimaligem Waschen mit PBS bei RT für 15 Minuten wurden die Zellen mit 4 % PFA bei RT für 10 Minuten nachfixiert, gefolgt vom Waschen und Nachfixieren wie oben beschrieben. Goldnanopartikel (90 nm) wurden 1:3 in PBS verdünnt und 10 Minuten bei RT inkubiert und die Probe wurde zweimal mit PBS gewaschen, um ungebundenes Gold zu entfernen. Die Imager-Lösung in Puffer C für die erste Runde wurde 5 Minuten lang inkubiert und dann durch frisches Imager ersetzt, woraufhin die erste Aufnahmerunde gestartet wurde. Zwischen den Bildgebungsrunden wurde die Probe mit mindestens 2 ml PBS gewaschen, bis kein Restsignal von der vorherigen Bildgebungslösung mehr erkannt wurde. Dann wurde die nächste Imager-Lösung eingeführt. Die RESI-Bildgebung wurde über vier aufeinanderfolgende Bildgebungsrunden mit nur einem der Bildgeber durchgeführt. In der letzten Bildgebungsrunde wurden die Imager R1, R2, R3 und R4 gleichzeitig zur Probe hinzugefügt, um eine Standard-DNA-PAINT-Messung durchzuführen.

Die Fluoreszenzbildgebung wurde unter Verwendung eines inversen Mikroskops (Nikon Instruments, Eclipse Ti2) mit dem Perfect Focus System durchgeführt, wobei eine TIRF-Konfiguration vom Objektivtyp verwendet wurde, die mit einem Ölimmersionsobjektiv ausgestattet war (Nikon Instruments, Apo SR TIRF ×100/numerische Apertur 1,49, Öl). Zur Anregung wurde ein 560-nm-Laser (MPB Communications, 1 W) verwendet. Der Laserstrahl wurde durch einen Reinigungsfilter (Chroma Technology, Nr. ZET561/10) geleitet und mithilfe eines Strahlteilers (Chroma Technology, Nr. ZT561rdc) an das Mikroskopobjektiv gekoppelt. Die Fluoreszenz wurde mit einem Emissionsfilter (Chroma Technology, Nr. ET600/50m und ET575lp) spektral gefiltert und ohne weitere Vergrößerung auf einer sCMOS-Kamera (Andor, Zyla 4.2 Plus) abgebildet, was zu einer effektiven Pixelgröße von 130 nm führte (nach 2 ×). 2 Binning). Die Ausleserate wurde auf 200 MHz eingestellt. Die Bilder wurden durch Auswahl eines interessierenden Bereichs mit einer Größe von 512 × 512 Pixel aufgenommen. Die 3D-Bildgebung wurde mit einer Zylinderlinse (Nikon Instruments, N-STORM) im Detektionspfad durchgeführt. Rohe Mikroskopiedaten wurden mit μManager41 (v.2.0.1) erfasst. Für 2D- und 3D-DNA-Origami-Daten sowie für die CD20-Erfassung wurde Totalreflexionsbeleuchtung verwendet. Für die Erfassung von NPC-Daten wurde eine hoch geneigte und laminierte optische Blattbeleuchtung (HILO) eingesetzt. Detaillierte Bildgebungsbedingungen für die jeweiligen Experimente sind in der erweiterten Datentabelle 1 aufgeführt.

Aufgrund der Heterogenität von Ziel und Probe variiert die optimale Imager-Konzentration c, die zur Erzielung eines spärlichen Blinkens verwendet wird. Hier verwendeten wir Konzentrationen von 100 pM (Nup96) bis 800 pM (DNA-Origami). Die optimalen Imager-Konzentrationen wurden für jede Probe visuell bestimmt. Die Konzentrationen wurden geändert, bis das Blinken häufig, aber ausreichend spärlich war, um eine gute DNA-PAINT-Auflösung zu erreichen.

Die durchschnittliche Anzahl erwarteter Bindungsereignisse pro Bindungsstelle während einer DNA-PAINT-Messung ergibt sich aus der Dauer der Messung tmeasurement und der mittleren Dunkelzeit τdark (definiert als \({\tau }_{{\rm{dark}}} =\frac{1}{{k}_{{\rm{on}}}\times c}\, wobei kon die On-Rate eines gegebenen Imager-Strangs ist) als:

Die durchschnittliche Anzahl der Lokalisierungen pro Bindungsereignis ergibt sich aus der mittleren Helligkeitszeit τbright und der Kamerabelichtungszeit exposure as

Daher beträgt die durchschnittliche Anzahl der erwarteten Lokalisierungen pro Bindungsstelle im Verlauf der Messung

Daraus folgt, dass die gesamte Erfassungszeit, die zum Sammeln von Nloc-Lokalisierungen erforderlich ist, im Durchschnitt beträgt

Die erforderliche Anzahl von Lokalisierungen, nloc, wird berechnet mit \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{DNA}} \mbox{-} { \rm{PAINT}}}}{\sqrt{{n}_{{\rm{loc}}}}}\), und somit \({n}_{{\rm{loc}}}={\ left(\frac{{\sigma }_{{\rm{DNA}} \mbox{-} {\rm{PAINT}}}}{{\sigma }_{{\rm{RESI}}}}\right )}^{2}\) mit der DNA-PAINT-Lokalisierungsgenauigkeit σDNA-PAINT.

Für erwartete Imager-Konzentrationen zwischen 50 und 800 pM, Belichtungszeiten zwischen 100 und 200 ms und zuvor berichtete Kinetiken32 variieren die zur Erfassung von 16 Lokalisierungen erforderlichen Zeiten (1 nm RESI-Präzision bei σDNA-PAINT = 4 nm) zwischen 42 s (R2, 800). pM, 100 ms Belichtungszeit) und 314 min (R5, 50 pM, 200 ms Belichtungszeit).

Rohe Fluoreszenzdaten wurden einer hochauflösenden Rekonstruktion mit dem Picasso-Softwarepaket9 (neueste Version verfügbar unter https://github.com/jungmannlab/picasso) unterzogen. Die Driftkorrektur wurde mit einer redundanten Kreuzkorrelation und Goldpartikeln als Referenzen für zelluläre Experimente oder mit einzelnen DNA-PAINT-Andockstellen als Referenzen für Origami-Experimente durchgeführt.

Die Ausrichtung nachfolgender Bildgebungsrunden wurde in Picasso9 iterativ durchgeführt, beginnend mit einer redundanten Kreuzkorrelation und gefolgt von einer Gold-Fiducial-Ausrichtung für Zellexperimente. Jedes DNA-Origami war mit zusätzlichen DNA-PAINT-Andockstellen ausgestattet, die in allen Bildgebungsrunden gleichzeitig mit den interessierenden Stellen abgebildet wurden, was ihre Verwendung als Referenzpunkte ermöglichte. Zunächst wurden in Picasso Render eine redundante Kreuzkorrelation (2D- und 3D-Origami-Messungen) und eine Goldausrichtung (3D-Messungen) durchgeführt. Um die nanoskopische Bewegung einzelner DNA-Origami während des Pufferaustauschs zu korrigieren, wurde die Kanalausrichtung nicht nur im gesamten Sichtfeld durchgeführt, sondern zusätzlich wurden kleine interessierende Bereiche ausgewählt, die nur ein DNA-Origami enthielten. Innerhalb jeder interessierenden Region wurde dann die Ausrichtung über die Referenz-Andockstellen des DNA-Origami durchgeführt. Dies wurde außerhalb von Picasso in einem benutzerdefinierten Python-Skript durchgeführt, nicht nur um die optimale Übersetzung zwischen den Kanälen zu finden, sondern auch um mögliche Drehungen des DNA-Origami zu korrigieren.

Nach der Kanalausrichtung wurden die DNA-PAINT-Daten für jede Bildgebungsrunde mithilfe eines benutzerdefinierten Clustering-Algorithmus analysiert. Dieser Algorithmus basiert auf der Tatsache, dass Lokalisierungen in DNA-PAINT unabhängige Messungen der Position eines Zielmoleküls sind und als Gauß-verteilt beobachtet werden. Um Lokalisierungen einem bestimmten Zielmolekül zuzuordnen, verwendeten wir zunächst eine Gradientenaufstiegsmethode, um das Zentrum einer Lokalisierungswolke für jedes Ziel zu finden. Anschließend ordneten wir alle kreisförmig um den Mittelpunkt verteilten Lokalisationen demselben Zielmolekül zu. Dies ist eine gültige Näherung, da aufgrund der Reduzierung der effektiven Zieldichte durch den sequentiellen Bildgebungsansatz von RESI die Mehrzahl der Lokalisierungswolken von einzelnen Zielen ausreichend weit voneinander entfernt sind.

Der Clustering-Algorithmus verwendet zwei Eingabeparameter: Radius r, der die endgültige Größe der Cluster festlegt und eine kreisförmige Umgebung um jede Lokalisierung definiert, und die minimale Anzahl von Lokalisierungen, nmin, die einen unteren Schwellenwert für die Anzahl von DNA-PAINT-Lokalisierungen in darstellt jeder Cluster.

Zunächst wird die Anzahl der benachbarten Lokalisierungen im Abstand r von jeder Lokalisierung berechnet. Wenn eine bestimmte Lokalisierung innerhalb ihres r-Radius mehr Nachbarn hat als alle benachbarten Lokalisierungen, wird sie als lokales Maximum betrachtet. Gibt es innerhalb eines Kreises mit dem Radius r um ein solches lokales Maximum mehr als nmin Lokalisationen, werden diese Lokalisationen demselben Cluster zugeordnet; Der Rest gilt nicht als Teil eines Clusters und wird bei der weiteren Analyse nicht berücksichtigt.

Eine weitere Clusterfilterung wird durchgeführt, um Cluster auszuschließen, die durch unspezifisches Anhaften von Bildgebern an der Probe entstehen. Zunächst wird der mittlere Frame (Mittelwert der Framenummern, in denen Lokalisierungen erfolgten) aller Lokalisierungen berechnet, die demselben Cluster zugeordnet sind. Bei wiederholtem Blinzeln wird erwartet, dass der mittlere Frame etwa halb so groß ist wie die Gesamtzahl der Frames42. Der Algorithmus schließt daher alle Cluster mit einem mittleren Frame in den ersten oder letzten 20 % der Frames aus. Zweitens können Sticking-Ereignisse in der Mitte der Erfassungszeit identifiziert werden, indem die Erfassungszeit in 20 Zeitfenster mit jeweils 5 % der Frames unterteilt wird. Wenn eines dieser Zeitfenster mehr als 80 % der Lokalisierungen im Cluster enthält, wird es als Sticking-Ereignis ausgeschlossen.

Die Wahl des Clusterradius r und des Schwellenwerts nmin hängt von den jeweiligen experimentellen Bedingungen ab. Ein geeigneter Wert für nmin kann geschätzt werden, indem in Picasso Render Lokalisierungswolken ausgewählt werden, die von einzelnen Zielmolekülen stammen (d. h. gut getrennt sind), Auswahleigenschaften exportiert werden und ein Histogramm der Anzahl der Lokalisierungen in jeder Auswahl erstellt wird. nmin wird ausgewählt, um zwischen Populationen zu unterscheiden, die einzelnen Zielen und Hintergrundlokalisierungen entsprechen.

Der Radius r skaliert mit der Größe der Lokalisierungswolken und damit der Lokalisierungsgenauigkeit. Wenn ein zu großer Wert gewählt wird, werden benachbarte Cluster möglicherweise nicht getrennt. Wenn r zu klein ist, kann es zu „Subclustering“ innerhalb einer Lokalisierung kommen. Letzteres führt auch zu einem NND-Spitzenwert beim Doppelten des Clusterradius. Ein guter A-priori-Startwert für r wird durch ungefähr das Doppelte der Lokalisierungsgenauigkeit der zugrunde liegenden DNA-PAINT-Messung dargestellt. Picasso Render bietet ein Tool (Test Clusterer), mit dem die Wirkung verschiedener Clustering-Parameter für einen kleinen interessierenden Bereich getestet werden kann.

Für 3D-Clustering wird ein zusätzlicher Radius für die z-Richtung eingeführt, da die Streuung der Lokalisierungen in z im Vergleich zu x und y etwa doppelt so groß ist.

Nach der Clusteranalyse wurden die Zentren der DNA-PAINT-Lokalisierungsgruppen als gewichtete (wtd) Mittelwerte unter Verwendung der quadrierten inversen Lokalisierungsgenauigkeiten \((\frac{1}{{{\text{lp}}}^{2} berechnet. })\) als Gewichte. Für x- und y-Koordinaten:

Für Z-Koordinaten wird ein Standardmittelwert ohne Gewichtungen zur Berechnung der Z-Positionen verwendet. Die Genauigkeit der resultierenden RESI-Lokalisierung ist das gewichtete Sem der zugrunde liegenden gruppierten Lokalisierungen:

Die Wahl für \(1/{{\text{lp}}}^{2}\) als Gewichte basiert auf dem folgenden Argument: Unter der Hypothese, dass Lokalisierungen unabhängig und normalverteilt mit demselben Mittelwert sind, basiert der gewichtete Mittelwert auf inversen Varianzen als Gewichtungen ist der Maximum-Likelihood-Schätzer des Mittelwerts des gesamten Satzes von Lokalisierungen. Daher ist die Varianz des gewichteten Mittelwerts minimal (der Schätzer ist optimal), wenn die inversen Varianzen einzelner Messungen \(1/{{\text{lp}}}^{2}\) als Gewichte gewählt werden.

Schließlich nehmen wir den Durchschnitt der resultierenden x- und y-Sem als endgültige Präzision jeder RESI-Lokalisierung. Für Z-Koordinaten wird die Genauigkeit auf das Zweifache der xy-Genauigkeit geschätzt. Durch das Speichern von RESI-Lokalisierungen in einer Picasso-HDF5-Datei konnten wir sie als Gaußsche Werte rendern, wobei sd ihrer jeweiligen Präzision entspricht.

Um die Leistung von RESI zu bewerten, wurden numerische In-silico-Simulationen durchgeführt. Der Algorithmus besteht aus den folgenden Schritten.

Es wird ein Raster definierter Positionen der Bindungsstellen (Ground Truth) generiert. Typischerweise wurde ein Positionsraster erstellt (Extended Data Abb. 1a, oben links).

SMLM (DNA-PAINT)-Lokalisierungen werden als Proben aus einer 2D-Gauß-Verteilung mit σ = σSMLM simuliert. Pro Bindungsstelle wird eine große Anzahl (M) von Lokalisierungen generiert (Extended Data Abb. 1a, oben rechts).

Für jede Bindungsstelle werden Teilmengen von K-Lokalisierungen zufällig ausgewählt (K << M). Dies führt zu \(n=\frac{M}{K}\) Teilmengen von SMLM-Lokalisierungen (Extended Data Abb. 1a, unten links), die dann gemittelt werden, um n RESI-Lokalisierungen zu generieren (Extended Data Abb. 1a, unten rechts) .

Die resultierenden RESI-Lokalisierungen werden dann in einem Histogramm dargestellt (Extended Data Abb. 1b) und die Spur (tr) der Kovarianzmatrix berechnet. Die RESI-Präzision wird wie folgt geschätzt: \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\sqrt{\frac{1}{2}tr({\rm{cov}}\left(x,y\right ))}\) (Erweiterte Daten Abb. 1c). Diese Definition wurde bereits in der Praxis als skalare Metrik für die 2D-Varianz8 verwendet.

Die Schritte 3 und 4 werden für verschiedene K-Werte wiederholt, um σ = σRESI(K) numerisch zu untersuchen.

Um die Präzision von RESI in experimentellen Daten zu bewerten, wurde eine analoge Methode verwendet. Kurz gesagt, die M-Gesamtzahl der DNA-PAINT-Lokalisierungen jeder Gruppe, die einer einzelnen Bindungsstelle entspricht, wurde zufällig in Teilmengen von K-Lokalisierungen neu abgetastet, dann wurden die obigen Schritte 4 und 5 durchgeführt, um σRESI zu bewerten. Der in Abb. 3d aufgetragene σRESI ist der Durchschnittswert aller einzelnen Bindungsstellen im Datensatz. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der verschiedenen σRESI-Werte dar, die für verschiedene Bindungsstellen berechnet wurden.

Beachten Sie, dass diese Analyse nur für K << M durchgeführt werden kann, um genügend \(n=\frac{M}{K}\) RESI-Lokalisierungen für eine statistisch signifikante Schätzung zu haben. Da die endgültige RESI-Lokalisierung alle M DNA-PAINT-Lokalisierungen berücksichtigt, wird die endgültige Präzision wie folgt extrapoliert: \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM }}}}{\sqrt{M}}\).

Bei RESI wird die spärliche Verteilung der Bindungsstellen in der Probe dadurch erreicht, dass eine einzelne Biomolekülart mit unterschiedlichen orthogonalen DNA-Sequenzen markiert wird. Der Markierungsprozess erfolgt auf stochastische Weise: n verschiedene Markierungen (z. B. DNA-konjugierte Nanobodies), die auf dieselbe Proteinart abzielen, werden gleichzeitig in der Probe inkubiert und somit die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass jedes einzelne Protein mit einer bestimmten Sequenz i markiert wird (d. h = 1, …, n) ist \({p}_{i}=\frac{1}{n}\), vorausgesetzt, dass die gleiche Konzentration jeder Markierung verwendet wird. Anschließend werden n Bildgebungsrunden durchgeführt, um alle Gruppen von Lokalisierungen aufzuzeichnen, die zum Erhalten des endgültigen RESI-Bilds erforderlich sind.

Die Mindestanzahl an Markierungen (n) und Runden, die erforderlich sind, um eine ausreichende Dichte an Bindungsstellen in jeder Bildgebungsrunde zu erreichen, hängt hauptsächlich von drei Faktoren ab: Präzision und Dichte der SMLM-Lokalisierung und der molekularen Anordnung des interessierenden Proteins. Hier beschreiben wir anhand einiger praktischer Beispiele, wie sich diese Parameter auf die endgültigen RESI-Ergebnisse auswirken.

Ein typischer Untersuchungsfall sind einzelne Proteine, die in Dimeren angeordnet sind, die wiederum eine andere spezifische räumliche Organisation im Raum darstellen. Dies ist beispielsweise beim Nup96 im NPC der Fall. In diesem Fall muss die stochastische Markierung so erfolgen, dass die Wahrscheinlichkeit der Markierung zweier Proteine, die ein Dimer mit unterschiedlichen Sequenzen bilden, ausreichend hoch ist. Für n Beschriftungs-/Bildgebungsrunden beträgt die Wahrscheinlichkeit

für n = 4 Beschriftungs-/Bildgebungsrunden P(diff. seq.) ≈ 75 %. Wir haben n = 4 gewählt, um zu zeigen, dass es mit nur wenigen Bildgebungsrunden einen relativ hohen P(diff. seq.) liefert. Wir stellen jedoch fest, dass n > 4 verwendet werden könnte, um P(diff. seq.) zu erhöhen und somit die spärliche Anzahl markierter Bindungsstellen in jeder Runde zu maximieren.

Um einen Satz aus einer beliebigen Anzahl von Molekülen (m) aufzulösen, die enger voneinander entfernt sind als die Auflösung von DNA-PAINT, müssen sie mit n orthogonalen Sequenzen markiert werden. Im Allgemeinen folgt der Anteil von m Molekülen, die mit n orthogonalen Sequenzen markiert sind, und damit der Anteil auflösbarer Molekülsätze der Gleichung

Dies ist ein häufiger Fall, beispielsweise bei Membranrezeptoren. Wenn Proteine ​​in einer CSR-Manier (Extended Data Abb. 14a) in einer bestimmten Dichte verteilt sind, kann DNA-PAINT bereits einzelne Proteine ​​auflösen, die ausreichend weit von ihren NNs entfernt sind. Wir gehen davon aus, dass Proteine ​​im Abstand d = 4 × σDNA-PAINT zuverlässig aufgelöst werden (beachten Sie, dass dieses Kriterium deutlich strenger ist als 2,35 × σDNA-PAINT). Dann kann für eine gegebene Dichte das NND-Histogramm berechnet und der Bruchteil der Abstände unter d berechnet werden (Erweiterte Daten, Abb. 14b). Dies stellt den Anteil einzelner Proteine, F, dar, der von DNA-PAINT nicht aufgelöst werden kann. Hier zeichnen wir F als Funktion der Dichte und Auflösung auf (Extended Data Abb. 14c). Eine solche Karte bietet bereits ein Werkzeug, um den Grad der SMLM-Auflösung zu verstehen, der zur Auflösung einzelner Proteine ​​bei einer bestimmten Dichte erforderlich ist.

RESI kann hier als eine Möglichkeit interpretiert werden, die effektive Dichte zu reduzieren, indem Ziele in verschiedene stochastisch markierte Teilmengen aufgeteilt werden. Daher wird die effektive Dichte jeder Runde gemäß der Formel \(\rho =\frac{{\rm{Dichte}}}{n}\) reduziert. Erweiterte Daten Abb. 14d zeigt eindimensionale Schnitte der 2D-Karte, um Leitlinien für die Auswahl der Anzahl orthogonaler Sequenzen (und damit Bildrunden) bereitzustellen, die für eine effiziente Durchführung von RESI erforderlich sind. Beispielsweise für eine anfängliche Auflösung von 20 nm (σ = 5 nm), die für DNA-PAINT im zellulären Kontext typisch ist, und eine Dichte von \({\rm{d}}{\rm{e}}{ \rm{n}}{\rm{s}}{\rm{i}}{\rm{t}}{\rm{y}}=200\,\frac{{\rm{m}}{\ rm{o}}{\rm{l}}{\rm{e}}{\rm{c}}{\rm{u}}{\rm{l}}{\rm{e}}{\rm {s}}}{\mu {{\rm{m}}}^{2}}\) (relativ hoch), n = 4 verschiedene Sequenzen reichen aus, um P(diff. seq.) ≈ 90 % für Proteine ​​bereitzustellen unten d (Extended Data Abb. 14d). Diese Proteine ​​können dann durch RESI aufgelöst werden.

Eine modellfreie Mittelung der Nup96-Daten wurde sowohl für die DNA-PAINT- als auch für die RESI-Messung desselben Kerns durchgeführt, wie von Wu et al.30 beschrieben. Die entsprechenden Picasso-HDF5-Dateien wurden in SMAP43 segmentiert und in einem für die Mittelwertbildung kompatiblen Dateiformat gespeichert, indem die Plugins segmentNPC, NPCsegmentCleanup und sitenumbers2loc verwendet wurden. Anschließend wurde eine modellfreie Mittelung an den resultierenden _sml.mat-Dateien mit Standardparametern durchgeführt, indem das Skript „particleFusion.m“ in Matlab ausgeführt wurde (verfügbar im SMAP-Quellcode). Die angezeigten Durchschnittswerte entsprechen dem Ergebnis der letzten Iteration, bei der jeder Punkt mit einem Gaußschen Wert von σ = 2 nm in x, y und z gerendert wird.

Um die Ergebnisse der NND-Daten in unbehandelten Zellen zu interpretieren, wurden numerische Simulationen durchgeführt. Kurz gesagt, zwei Populationen, eine aus CD20-Monomeren und eine aus Dimeren mit einer CSR-Verteilung, wurden simuliert und dann ihre NNDs berechnet. Der Algorithmus lässt sich wie folgt zusammenfassen:

Auswahl der Parameter. Dichte der Monomere: Anzahl der Monomere pro Flächeneinheit; Dichte der Dimere: Anzahl der Dimere pro Flächeneinheit; Dimerabstand: erwarteter Abstand zwischen den beiden Molekülen einschließlich des Markierungskonstrukts; Unsicherheit: Variabilität der Position jedes Moleküls aufgrund von Markierungs- und Lokalisierungsfehlern; Markierungseffizienz: Anteil der Ground-Truth-Moleküle, die tatsächlich markiert und gemessen werden. Die beobachtete Dichte, die mit dem experimentellen Parameter übereinstimmen muss, wird dann zu beobachteter Dichte = (Dichte der Monomere + Dichte der Dimere) × Markierungseffizienz. Zur Quantifizierung der Markierungseffizienz des DNA-konjugierten GFP-Nanokörpers verwendeten wir eine vorübergehend transfizierte CHO-Zelllinie, die einen GFP- und Alfa-Tag am C-Terminus eines monomeren Membranproteins (z. B. CD86) exprimiert. Anschließend markierten wir GFP- und Alfa-Tag mithilfe ihrer zugehörigen Nanokörper, die an zwei orthogonale Docking-Sequenzen konjugiert waren, und führten zwei Runden Exchange-PAINT durch. Anschließend haben wir die am besten passenden Parameter für eine Probe erhalten, die aus GFP/Alfa-Tag-Paaren und isolierten Alfa-Tags besteht, ähnlich wie bei der CD20-Dimer/Monomer-Analyse. Das Verhältnis dieser beiden Populationen wird dann als Schätzung der Etikettierungseffizienz verwendet. Ausführliche Informationen zum Quantifizierungsansatz finden Sie in einem derzeit in Vorbereitung befindlichen Manuskript.

Simulation von Monomeren: Ein Satz räumlicher Koordinaten mit CSR-Verteilung und gegebener Dichte wird gezeichnet; Simulation von Dimeren: Es wird ein Satz räumlicher Koordinaten mit CSR-Verteilung gezeichnet, die das Zentrum jedes Dimers darstellen. Für jedes Dimerzentrum werden zwei Positionen mit zufälliger Ausrichtung und einem Abstand mit dem erwarteten Wert Dimerabstand generiert. Die Position jedes Molekülpaares wird unter Berücksichtigung des Unsicherheitsparameters (aus einer Gaußschen Verteilung) gezeichnet.

Eine zufällige Teilmenge „nachweisbarer“ Moleküle wird aus der Grundwahrheitsmenge entnommen (Bruchteil = Markierungseffizienz), um den Markierungsprozess zu simulieren.

NNDs werden anhand der Teilmenge der nachweisbaren Moleküle berechnet.

Die Parameter Dichte der Monomere = 212 μm–2, Dichte der Dimere = 0 μm–2, Unsicherheit = 5 nm und Markierungseffizienz = 50 % wurden verwendet, um Daten für RTX-behandelte Zellen mit einer CSR-Verteilung der Monomere zu vergleichen.

Für den unbehandelten Fall wurden die am besten geeigneten Parameter durch einen iterativen, nichtlinearen Algorithmus der kleinsten Quadrate ermittelt. Für die Simulation wird die experimentell beobachtete Dichte (50 Moleküle µm–2) verwendet.

Für jeden Parametersatz wird eine Simulation durchgeführt, NNDs werden histogrammiert und die Summe der quadrierten Differenzen zwischen der Simulation und dem experimentellen Histogramm berechnet. Bei einer Anpassung geht es darum, die Parameter zu finden, die die Summe der quadrierten Differenzen minimieren.

D, durchschnittlicher Dimerabstand (nm)

σ_label, durch die Markierung eingeführte Variabilität (nm)

frac_of_dimers, Anteil der Dimere (%)

Hinweis: frac_of_monomers = 100 – frac_of_dimers

Führen Sie eine Grobanpassung über einen großen Parameterbereich durch, um den Bereich der am besten angepassten Parameter zu bestimmen. Bereich D = 1–20 nm, σ_label = 1–20 nm, frac_of_dimers = 0–100 %.

Führen Sie eine Feinanpassung über einen reduzierten Parameterraum um die am besten angepassten Ergebnisse im vorherigen Schritt durch.

Nun werden die Parameter D_opt, σ_label_opt und frac_of_dimers_opt gefunden, die am besten zum vorgeschlagenen Modell und den Daten passen. In diesem Fall ergab sich D_opt = 13,5 nm, σ_label_opt = 5,5 nm, frac_of_dimers_opt = 47 % (Abb. 4e, f).

M wird erstellt (in diesem Fall M = 100), simuliert (unter Verwendung der Datensätze D_opt, σ_label_opt, frac_of_dimers_opt) mit der gleichen Anzahl von Molekülen wie die experimentellen Daten (ca. 21.000).

M Datensätze werden fein angepasst und die am besten angepassten Parameter D_opt, σ_label_opt und frac_of_dimers_opt werden erhalten. Es werden drei Sätze erhalten: D_opt, σ_label_opt und frac_of_dimers_opt.

Die Verteilungen von D_opt, σ_label_opt und frac_of_dimers_opt werden untersucht. Die Standardabweichung kann als Schätzung der in b erhaltenen Parameterunsicherheiten verwendet werden.

Nun werden die Unsicherheiten der Parameter D_opt, σ_label_opt und frac_of_dimers_opt ermittelt.

Lokalisierungsdaten aus dieser Studie sind bei Zenodo verfügbar (https://doi.org/10.5281/zenodo.7795826). Während dieser Studie gewonnene Rohmikroskopiedaten sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

RESI kann mit Picasso v.0.6.0 durchgeführt werden, verfügbar unter https://github.com/jungmannlab/picasso, mit Dokumentation unter https://picassosr.readthedocs.io/en/latest/render.html. Die in dieser Studie verwendeten benutzerdefinierten Skripte sind unter https://github.com/jungmannlab/resi verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Y.-L. Wu und J. Ries für wertvolle Unterstützung bei der modellfreien Mittelwertbildung. Wir danken J. Schmied und F. Schueder für hilfreiche Diskussionen. Wir danken MK Steen-Mueller und I. Glueck für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Forschung wurde zum Teil vom Europäischen Forschungsrat durch einen ERC Consolidator Grant (ReceptorPAINT, Fördervereinbarung Nr. 101003275), der Deutschen Forschungsgemeinschaft durch SFB1032 (Projekt A11, Nr. 201269156) und der Dänischen Nationalen Forschungsstiftung (Centre for Cellular) finanziert Signal Patterns, DNRF135), das Human Frontier Science Program durch ein Young Investigator Grant (Nr. HFSP RGY0065/2018), die VolkswagenStiftung durch die Initiative „Life? – A Fresh Scientific Approach to the Basic Principles of Life“ (Stipendium Nr. 98198), der Max-Planck-Stiftung und der Max-Planck-Gesellschaft. SS und TS danken der QBM-Graduiertenschule für ihre Unterstützung. SCMR, IB, PRS, ASE, EMU und MTS bedanken sich für die Unterstützung durch die Graduiertenschule IMPRS-LS. IB dankt Roche für die finanzielle Unterstützung. LAM dankt für ein Postdoktorandenstipendium aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2021–2022 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Stipendienvereinbarung Nr. 101065980.

Open-Access-Förderung durch die Max-Planck-Gesellschaft.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Susanne CM Reinhardt, Luciano A. Masullo, Isabelle Baudrexel, Philipp R. Steen

Max-Planck-Institut für Biochemie, Planegg, Deutschland

Susanne C. M. Reinhardt, Luciano A. Masullo, Isabelle Baudrexel, Philipp R. Steen, Rafal Kowalewski, Alexandra S. Eklund, Sebastian Strauss, Eduard M. Unterauer, Thomas Schlichthaerle, Maximilian T. Strauss & Ralf Jungmann

Fakultät für Physik und Center for NanoScience, Ludwig-Maximilians-Universität, München, Deutschland

Susanne C. M. Reinhardt, Philipp R. Steen, Rafal Kowalewski, Sebastian Strauss, Eduard M. Unterauer, Thomas Schlichthaerle, Maximilian T. Strauss & Ralf Jungmann

Fachbereich Chemie und Biochemie, Ludwig-Maximilians-Universität, München, Deutschland

Isabelle Baudrexel, Alexandra S. Eklund & Christian Klein

Roche Innovation Center Zürich, Roche Pharma Research and Early Development, Schlieren, Schweiz

Christian Klein

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Das SCMR entwarf und führte 2D- und 3D-DNA-Origami- sowie Nup96-Experimente durch, entwickelte die Analysesoftware und analysierte DNA-Origami- und Nup96-Daten. LAM entwarf und führte Computersimulationen durch, trug zur Analysesoftware bei und analysierte DNA-Origami-, Nup96- und CD20-Daten. IB hat CD20-Experimente entworfen und durchgeführt und CD20-Daten analysiert. PRS entwarf und führte 2D-DNA-Origami-Experimente durch, trug zur Analysesoftware bei und analysierte DNA-Origami- und Nup96-Daten. RK und TS haben zur Analysesoftware beigetragen. SS entwickelte Markierungssonden. ASE, SS, EMU und MTS führten vorläufige RESI-Experimente durch. CK trug zum Design von Studien zum Thema CD20 und deren Interpretation bei. SCMR, LAM, IB, PRS und RJ interpretierten die Daten und verfassten das Manuskript. RJ konzipierte das Konzept, entwarf Experimente und überwachte die Studie. SCMR, LAM, IB und PRS trugen gleichermaßen bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Ralf Jungmann.

CK erklärt Beschäftigung, Patente (nicht im Zusammenhang mit dieser Arbeit) und Aktienbesitz bei Roche.

Nature dankt Alistair Curd und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a: Ein Raster definierter Positionen von Bindungsstellen wird generiert (oben links), SMLM (DNA-PAINT)-Lokalisierungen werden als Proben aus einer Gaußverteilung simuliert (oben rechts). Der Übersichtlichkeit halber wurden die Lokalisierungen nur für eine Bindungsstelle aufgezeichnet. Für jede Bindungsstelle werden Teilmengen von K-Lokalisierungen zufällig ausgewählt (unten links) und gemittelt (unten rechts). Eine beispielhafte Teilmenge und ihr Durchschnitt werden hervorgehoben. b: Resultierende RESI-Lokalisierungen werden histogrammiert, um Bilder mit unterschiedlichen Auflösungen (K-Werten) zu erzeugen. c, RESI-Lokalisierungsgenauigkeit σRESI vs. K. Analytische Abhängigkeit von \(\sqrt{K}\) (blaue Linie) und numerischen Ergebnissen (schwarze Punkte). Insgesamt werden 1200 SMLM-Lokalisierungen pro Standort simuliert. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± 1 Standardabweichung dar

a, DNA-Origami-Design mit sechs orthogonalen Docking-Strangpaaren im Abstand von 5 nm (rot R1, blau R3) und sechs Ausrichtungs-Docking-Strängen (grün R4). Einzelheiten zur Sequenz finden Sie unter Methoden. b: Die DNA-PAINT-Erfassungsparameter wurden so eingestellt, dass 5 nm nicht konsistent auflösbar waren. c, Erste Bildgebungsrunde, durchgeführt mit R1- (Ziel) und R4-Bildgebern (Ausrichtung, Standorte eingekreist). d, Zweite Bildgebungsrunde durchgeführt mit R3 (Ziel) und Ausrichtungsbildgebern (R4, Orte eingekreist). Die Ausrichtungsstellen wurden für die translatorische und rotatorische Ausrichtung zwischen den Runden verwendet. e, RESI löst die 5-nm-Abstände auf. f, Der Abstand und die Ausrichtung zwischen den Andocksträngen R1 und R3 stimmen mit dem Design überein. g: Ein Durchschnitt von 90 DNA-Origami-Strukturen zeigt konsistente Ergebnisse und eine hervorragende Ausrichtungsleistung. Die Zahlen geben den Abstand zwischen den Runden an.

Repräsentatives DNA-Origami aus dem gesamten Sichtfeld der Messung. a, Vier DNA-Origami, dargestellt mit DNA-PAINT-Auflösung (obere Reihe) und RESI-Auflösung (untere Reihe). Der Einsatz zeigt ein Paar Andockstränge im Abstand von ca. 5 nm. b, 40 zusätzliche DNA-Origami, dargestellt mit DNA-PAINT-Auflösung (obere Reihen) und RESI-Auflösung (untere Reihen).

a, DNA-Origami-Design mit einem Paar orthogonaler Andockstränge (rot R1, blau R3) sowie sechs ausgerichteten Andocksträngen (grün R4). Andockstränge erstrecken sich sowohl von der Ober- als auch von der Unterseite des DNA-Origami (Einsatz). b, Das Design stellt sicher, dass alle bis auf das R1/R3-Andockstrangpaar einen ausreichenden Abstand haben, um von DNA-PAINT aufgelöst zu werden. c: Die 3D-DNA-PAINT-Bildgebung löst R4-Ausrichtungsstellen auf, löst R1/R3 kaum axial auf und löst R1/R3 lateral nicht auf. d, Sequentielle 3D-DNA-PAINT-Bildgebung mit zur Ausrichtung verwendeten R4-Stellen. e, RESI löst R1/R3 sowohl axial als auch lateral auf. f, Eine Überlagerung von 88 DNA-Origami zeigt trotz struktureller Heterogenität insgesamt eine gute Ausrichtung. g, Durchschnitt von 88 DNA-Origamis. h, Der Partikeldurchschnitt stellt die Struktur mit einer Ausrichtungsunsicherheit von 0,7 nm CI = [0, 1,6] nm wieder her und zeigt einen Abstand zwischen den durchschnittlichen R1/R3-Positionen von 11,6 ± 0,8 nm (xy-Abstand: 2,5 ± 0,4 nm, z -Entfernung: 11,3 ± 0,8 nm), passend zu den vorgesehenen Entfernungen20. Für alle Vergrößerungstafeln gilt der gleiche Maßstab. CI beschreibt ein 68 %-Konfidenzintervall.

Repräsentatives 3D-DNA-Origami aus dem gesamten Sichtfeld der Messung. a, Fünf DNA-Origami, dargestellt mit DNA-PAINT-Auflösung (obere Reihe) und RESI-Auflösung (untere Reihe). Die Farbskala rechts stellt die Z-Position der Lokalisierungen dar. Die gemessenen z-Koordinaten für jedes DNA-Origami wurden um eine Konstante verschoben, sodass die niedrigste Lokalisierung für eine bestimmte Struktur bei z = 0 definiert ist. Dadurch wird die volle Nutzung des Farbbereichs sichergestellt. b, 32 zusätzliche DNA-Origami, dargestellt mit DNA-PAINT-Auflösung (obere Reihen) und RESI-Auflösung (untere Reihen). Die Z-Positionen sind entsprechend der Farbskala in Bild a eingefärbt.

Repräsentative NPCs aus dem gesamten Sichtfeld der Messung. a, Sechs NPCs, gemessen mit DNA-PAINT (obere Reihe) und RESI (untere Reihe). Die Farbskala rechts stellt die Z-Position der Lokalisierungen dar. Die gemessenen Z-Koordinaten für jeden NPC wurden um eine Konstante verschoben, sodass die niedrigste Lokalisierung für eine bestimmte Struktur bei z = 0 definiert ist. Dadurch wird die volle Nutzung des Farbbereichs sichergestellt. b, 72 zusätzliche NPCs, gemessen mit DNA-PAINT (obere Reihen) und RESI (untere Reihen). Die Z-Positionen sind entsprechend der Farbskala in Bild a eingefärbt.

a, Modellfreie Mittelung für DNA-PAINT-Messungen von Nup96 (N = 1045 NPCs). Es wird eine isometrische Schrägansicht angezeigt. b–d, DNA-PAINT löst nukleoplasmatische und zytoplasmatische Ringe auf und rekapituliert ihre achtfache Symmetrie, kann jedoch keine einzelnen Nup96-Proteine ​​auflösen. e, Seitenansichten aller Nup96-Paare in beiden Ringen zeigen die abgewinkelte Ausrichtung, lösen jedoch keine einzelnen Nup96-Proteine ​​auf. f, Modellfreie Mittelung für RESI-Messungen von Nup96 (N = 1190 NPCs). g–i rekapituliert RESI nukleoplasmatische und zytoplasmatische Ringe sowie deren achtzählige Symmetrie und löst in den meisten Fällen einzelne benachbarte Nup96-Proteine ​​auf. j, Seitenansichten aller acht Nup96-Paare in beiden Ringen zeigen die abgewinkelte Ausrichtung sowie in einigen Fällen benachbarte einzelne Nup96-Proteine. k, Die Kryo-EM-Struktur des Kernporenkomplexes zeigt, dass ein bestimmtes Nup96-Protein Nachbarn hat, die 11 nm, 39 nm, 71 nm, 93 nm und 101 nm voneinander entfernt sind. l: Die Durchführung einer Clustering- und Nearest-Neighbor-Analyse für DNA-PAINT-Daten zeigt einen Peak bei ca. 40 nm, entsprechend dem Abstand zwischen zwei Nup96-Paaren, jedoch nicht darunter. RESI hingegen weist einen ersten Peak bei ca. auf. 15 nm, entsprechend dem Abstand zwischen benachbarten Nup96 unter Berücksichtigung des Verknüpfungsfehlers (Etikettengröße). m, Die Analyse der Abstände des ersten bis zehnten nächsten Nachbarn für RESI und DNA-PAINT rekapituliert die Abstände aus (k), aber nur RESI löst den kleinsten Abstand auf. Alle Maßstabsbalken: 20 nm.

Repräsentatives DNA-Origami aus dem gesamten Sichtfeld der Messung. a, Vier DNA-Origami, dargestellt mit DNA-PAINT-Auflösung (obere Reihe) und RESI-Auflösung (untere Reihe). Die Einfügungen zeigen Paare direkt benachbarter Andockstränge, die durch RESI aufgelöst wurden. b, 42 zusätzliche DNA-Origami, dargestellt mit DNA-PAINT-Auflösung (obere Reihen) und RESI-Auflösung (untere Reihen).

a, DNA-Origami mit sechs Ausrichtungssträngen (grün R4) und sechs Paaren orthogonaler Andockstränge (rot R1, blau R3) im Abstand von einem Basenpaar. b: Die RESI-Darstellung mit RESI-Lokalisierungen aus Runde 1 in Rot und Runde 2 in Blau veranschaulicht eine hervorragende Ausrichtung. Die Abstände zwischen den RESI-Lokalisierungen aus Runde 1 und 2 werden wie dargestellt definiert. c: Durch Überlagern von 42 DNA-Origami und Durchführen eines Partikelmittelwerts wird die Struktur mit einer Ausrichtungsunsicherheit von 1,2 Å CI = [0, 4,6] Å wiederhergestellt, wobei die Abstände zwischen den durchschnittlichen Positionen der Standorte bei 9,5 ± 2,6 Å liegen (Mittelwert über sechs Abstände in). der Durchschnitt ± Mittelwert über die fehlerbedingten Unsicherheiten der sechs Entfernungen). Für alle Vergrößerungstafeln gilt der gleiche Maßstab. CI beschreibt ein 68 %-Konfidenzintervall.

a: DNA-PAINT-Bildgebung ganzer mEGFP-CD20-exprimierender CHO-Zellen, markiert mit Anti-GFP-Nanokörpern, zeigt homogen verteilte Moleküle für drei unabhängige Experimente. b: Vergrößerte Regionen von DNA-PAINT zeigen Fälle, in denen Dimere nicht aufgelöst werden konnten. c, RESI zeigt Rezeptorpaare mit einem Abstand von weniger als 10 nm, die in den DNA-PAINT-Fällen nicht auflösbar sind. d, Ganzzellanalyse der Abstände des ersten nächsten Nachbarn (1. NNDs) von CD20-Rezeptoren (Histogramme der Abstände werden angezeigt). Nur RESI, nicht jedoch DNA-PAINT, ermöglicht die routinemäßige Erkennung von Abständen unter 10 nm zwischen Proteinen. Die RESI-Lokalisierungsgenauigkeit unter 1 nm ermöglicht die routinemäßige Erkennung von Abständen unter 10 nm, was zu einer genauen Beurteilung des ersten NND führt.

a, DNA-PAINT-Übersichtsbild von mEGFP-CD20 exprimierenden CHO-Zellen, behandelt mit RTX. b: Die Markierung mit DNA-konjugierten Anti-GFP-Nanokörpern und die Bildgebung mit DNA-PAINT zeigen eine Organisation höherer Ordnung nach der RTX-Behandlung. RESI (Einschübe i–iii) erreicht eine molekulare Auflösung und löst dadurch die molekulare Anordnung von mEGFP-CD20 auf. c, DNA-PAINT-Bildgebung zeigt geclusterte CD20-Moleküle. Die Durchführung von RESI mit den Sequenzen R1, R2, R3 und R4 in vier separaten Bildgebungsrunden (farbcodiert) ermöglicht die Clusterung von Lokalisierungen, die von einem einzelnen Ziel stammen. Aus den geclusterten Lokalisierungen wurden RESI-Lokalisierungen berechnet, die eine echte Einzelproteinauflösung ermöglichten.

a: DNA-PAINT-Bildgebung ganzer mEGFP-CD20-exprimierender CHO-Zellen, markiert mit Anti-GFP-Nanokörpern, zeigt geclusterte CD20-Moleküle in Rituximab-behandelten Zellen für drei unabhängige Experimente. b: Vergrößerte Regionen von DNA-PAINT zeigen, dass mEGFP-CD20 in kettenähnlichen Anordnungen geclustert ist. c, RESI zeigt Rezeptorpaare mit Abständen von weniger als 10 nm innerhalb der Cluster, die durch DNA-PAINT nicht auflösbar sind. d, Ganzzellanalyse der Abstände des ersten nächsten Nachbarn (1. NNDs) von CD20-Rezeptoren, die an Rituximab gebunden sind (Histogramme der Abstände werden angezeigt). Nur RESI, nicht jedoch DNA-PAINT, ermöglicht die routinemäßige Erkennung von Abständen unter 10 nm zwischen Proteinen. e: Die routinemäßige Erkennung von Abständen unter 10 nm durch RESI fasst den ersten NND zusammen, der im unbehandelten Fall gemessen wurde. Bemerkenswert ist, dass die in den drei Wiederholungen gemessenen NND-Peaks unabhängig von der Proteindichte konsistent sind.

a, Beispiel für Ground Truth-simulierte CD20-Hexamere (hellblaue Kreise, simuliert als Dreiecke von Dimeren mit experimentell gemessenen Intra-Dimer-Abständen von 13,5 nm) mit zufälliger Verteilung und Orientierung auf einer 2D-Oberfläche bei der experimentell bestimmten Dichte. b: Markierungsunsicherheit und Markierungseffizienz (schwarze Kreise zeigen markierte Moleküle an) werden in der Simulation für einen realistischen Vergleich berücksichtigt. c: Simulierte Proteine ​​in hexameren Anordnungen, dargestellt als Gaußsche Proteine. d, Hexamere nach DBSCAN-Clusteranalyse (Farben zeigen Cluster an). e, RESI-Bild von CD20-Daten nach RTX-Behandlung. f, RESI-Lokalisierungen von CD20-Daten nach DBSCAN-Clusteranalyse (Farben zeigen Cluster an). g, Anzahl der Moleküle pro detektiertem Cluster für die experimentellen Daten und die simulierten Hexamere. h, Zirkularitätsmetrik der experimentellen Daten und der simulierten Hexamere nach konvexer Hüllenanalyse der Cluster. Wir stellen fest, dass der starke Abfall bei 0,605 auf die maximale Zirkularitätsmetrik für Cluster zurückzuführen ist, bei denen die konvexe Hülle durch drei Moleküle definiert ist. Bemerkenswert ist, dass das Fehlen eines Zirkularitätspeaks bei ~0,7 in den experimentellen Daten darauf hindeutet, dass CD20-Moleküle nicht in isolierten ringartigen hexameren Strukturen angeordnet sind.

a, Beispielhafte Simulation von Proteinen mit einer Complete Spatial Random (CSR)-Verteilung einer gegebenen Dichte. b, Histogramm der Entfernungen zum nächsten Nachbarn (NNDs). Die rote Linie zeigt den kleinsten Abstand (d) an, der von DNA-PAINT für einen bestimmten Satz von Bildgebungsparametern aufgelöst werden kann. Der Anteil der Moleküle mit einem NN unterhalb dieser Abstandsschwelle (blau, schattiert) kann für eine gegebene Dichte und eine gegebene DNA-PAINT-Auflösung berechnet werden. c, 2D-Karte des Anteils nicht auflösbarer Moleküle als Funktion von Dichte und Auflösung. d, 1D-Schnitte von c mit unterschiedlichen Auflösungen (farbcodiert) können als Benutzerleitfaden verwendet werden, um die Anzahl der Multiplex-Runden abzuschätzen, die für eine effiziente Durchführung von RESI bei einem bestimmten Zielanteil nicht auflösbarer Entfernungen erforderlich sind.

Klammerstrangsequenzen für 2D-DNA-Origami mit Bindungsstellen im Subnanometer-, 5-nm- und 20-nm-Abstand und Klammerstrangsequenzen für 3D-Origami.

Gerüststrangsequenz (M13mp18) für 2D-DNA-Origami.

Gerüststrangsequenz (p7560) für 3D-DNA-Origami.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Reinhardt, SCM, Masullo, LA, Baudrexel, I. et al. Fluoreszenzmikroskopie mit Ångström-Auflösung. Natur 617, 711–716 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9

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Eingegangen: 21. Juli 2022

Angenommen: 07. März 2023

Veröffentlicht: 24. Mai 2023

Ausgabedatum: 25. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9

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